█导语 .

高等生物的免疫系统是一个复杂的动态网络，由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成，是机体识别和应对病原体、维持内环境稳态的核心防御机制。免疫细胞通过信号传递和表观遗传调控协调免疫应答，其高度异质性和可塑性使得全面理解免疫机制需要解析基因表达谱和表观遗传动态。为了更深入地揭示免疫系统的复杂性，单细胞多组学技术应运而生，其中scATAC-seq与scRNA-seq双组学技术的结合尤为重要。

scATAC-seq与scRNA-seq双组学技术可以在单细胞水平上构建免疫细胞的表观遗传-转录调控网络，揭示免疫细胞分化、激活和功能调控的分子机制。此外，scATAC-seq与scRNA-seq双组学技术还可以应用于免疫疾病机制研究、免疫治疗优化等领域，为深入探索免疫系统的复杂调控网络提供关键信息，推动精准免疫治疗的发展。

  scATAC-seq在免疫研究中的文献概览  

scATAC-seq技术在免疫研究中的应用迅速增长，已成为解析免疫相关研究的表观遗传调控的重要工具。根据10X官网的统计数据，scATAC-seq在免疫方向的研究已发表98篇论文，且发文量逐年攀升。研究主要集中在人类和小鼠模型，跨物种比较研究较少。研究覆盖了多种组织和细胞，包括外周血、脾脏、肺等组织以及各类免疫细胞。文章影响因子≥10分的占比将近80%，这表明scATC-seq技术在免疫研究中的应用具有极高的学术影响力和研究价值。scATAC-seq在免疫研究中的应用方向多样，主要包括：细胞分化、疾病机理（如自身免疫性疾病、肿瘤免疫微环境、感染性疾病）和疾病治疗机制等。

图1 10X官网数据统计结果

1.scATAC-seq在免疫研究中的应用——细胞分化  

2.scATAC-seq在免疫研究中的应用——疾病机理  

3.scATAC-seq在免疫研究中的应用——疾病治疗机制  

4.scATAC-seq在免疫研究中的应用——病毒感染  

  scATAC-seq在免疫研究中的经典案例  

  应用一、细胞分化研究：T 细胞耗竭克隆分化轨迹研究  

文章题目：Divergent clonal differentiation trajectories of T cell exhaustion

发表期刊：Nature Immunology

发表时间：2022年11月

影响因子：27.8

DOI：10.1038/s41590-022-01337-5

研究背景：病毒感染和癌症期间的慢性抗原暴露会导致 CD8+ T 细胞反应受损，其特征是效应功能降低、增殖能力降低和抑制性受体高表达，称为 T 细胞耗竭（Tex）。耗竭的T细胞仍旧维持一些效应功能并长期存在，目前缺乏对 Tex 状态、它们的克隆关系以及它们分化的分子程序的全面认识，尤其是在多克隆 T 细胞反应中。

研究思路：

研究结果：该研究通过单细胞多组学技术构建了慢性病毒感染期间T细胞耗竭（Tex）的综合图谱，揭示了新的Tex亚群及其分子调控程序，并阐明了Tex克隆的分化轨迹和TCR信号强度对克隆行为的影响。研究发现，两个后期Tex亚型：分别为具有终末衰竭（Texterm）和表达杀伤细胞凝集素样受体细胞毒性 (TexKLR) 的表型。另外，利用scRNA-seq、scTCR-seq和scATAC-seq联合分析，揭示了Tex细胞在慢性感染中表现出多种分化轨迹，包括从早期效应耗竭细胞（Texeeff）到耗竭进展期细胞（Texprog）或中间耗竭细胞（Texint）、Texint到Texterm或TexKLR的转变。最后，在人类肿瘤浸润淋巴细胞中发现了相似的Tex克隆行为。总之，这些发现揭示了在慢性抗原暴露下T细胞的克隆异质性。

  应用二、疾病标志物研究：表达LGR5的皮肤成纤维细胞是参与硬皮病发病的关键细胞  

文章题目：LGR5 expressing skin fibroblasts define a major cellular hub perturbed in scleroderma

发表期刊：Cell

发表时间：2022年4月

影响因子：45.6

DOI：10.1016/j.cell.2022.03.011

研究背景：系统性硬化症（SSc）也叫硬皮病，是一种罕见的慢性自身免疫性疾病，主要特征是皮肤，关节和内脏器官弥漫性纤维化和血管异常。目前尚无特异性的治疗方法，主要是针对并发症的治疗。硬皮病的主要分为两类：局限性硬皮病和弥漫性硬皮病。两种亚型均会累及内脏器官，但严重程度不同，目前仍未确定这两种亚型是代表不同的分子疾病谱还是同一疾病谱的不同的两端。由于目前的免疫调节治疗对硬皮病的作用效果不显著，因此免疫成分对该病的发生和病程的维持是否具有作用还是一个未知的问题。

研究思路：

研究结果：通过对健康对照、局限性和弥漫性系统性硬化症（SSc）患者的血液和皮肤活检进行scRNA-seq测序发现，尽管SSc被认为是一种免疫介导的疾病，但免疫细胞的变化仅局限于早期或高皮肤评分的弥漫性SSc（dSSc）患者亚型，而大多数dSSc患者的主要扰动集中在基质细胞区室。研究定义了10种皮肤成纤维细胞状态，并发现表达LGR5受体的成纤维细胞亚群在dSSc患者中显著减少，所以被称为硬化症相关成纤维细胞（ScAFs）。接着收集9例健康样本和9例dSSc样本进行scATAC-seq与scRNA-seq双组学测序（一胞双组），分别获得6710个和2417个基质细胞，并比较两组皮肤基质细胞差异的ATAC峰，发现dSSc患者的开放染色质区域富含AP-1基序（如ATF3、JUN、FOS等）和其他转录因子（如BACH1、MAFK、TEAD1/3），暗示该TF环路是从健康到致病性ScAF转变的主要候选调节因子。此外，利用单分子原位荧光杂交和免疫组织化学分析健康皮肤中的ScAFs主要分布在深层网状真皮层，而在SSc患者中其数量和形态显著改变。研究还发现ScAFs与皮肤免疫和基质区室存在大量配体-受体相互作用。综上所述，这项研究通过大规模单细胞测序和临床数据结合，确定了LGR5表达的成纤维细胞亚群（ScAFs）是SSc患者病理变化的核心，针对ScAFs相关通路的靶向治疗可能为SSc治疗开辟新方向。

  应用三、疾病治疗机制研究：CD27–TRAF2–SHP-1信号轴初始 T 细胞记忆基因网络重构  

文章题目：Signaling via a CD27-TRAF2-SHP-1 axis during naive T cell activation promotes memory-associated gene regulatory networks

发表期刊：Immunity

发表时间：2024年2月

影响因子：25.5

DOI：10.1016/j.immuni.2024.01.011

研究背景：CD27为肿瘤坏死因子受体家族成员之一，它通过与CD70结合来调节T细胞信号，有助于T细胞向记忆细胞方向发展，而不是成为效应细胞，这对免疫疗法至关重要。来自福瑞德·哈金森癌症研究中心的Stanley R. Riddell团队发现CD27与配体CD70结合引起CD27内化和降解，激活TRAF2和SHP-1，从而诱导T细胞分化为记忆T细胞，而不是成为效应细胞。将CD27信号融入CAR-T细胞设计能够进一步优化抗癌表现。   

研究思路：

研究结果：CD27共刺激在T细胞激活和CAR-T细胞治疗中通过调节信号传导和增强记忆T细胞特性，提高了T细胞的持久性和抗肿瘤效果：（1）在初始 T 细胞（Tn）中，通过构建功能性CD70三聚体配体，CD27与其配基CD70结合后迅速发生内化，并招募肿瘤坏死因子受体相关因子2（TRAF2）和磷酸酶SHP-1。（2）在CD28共刺激信号协同作用下，CD27-TRAF2-SHP-1信号轴调控酪氨酸激酶Lck磷酸化，从而促进T细胞向记忆性T细胞演化。（3）结合scRNA-seq和scATAC-seq技术，验证并揭示与CD28共刺激的αCD3激活的Tn细胞相比，通过CD27共刺激会短暂抑制细胞周期，并诱导不同的代谢、转录和表观遗传状态。（4）CD27共刺激的CAR-T细胞表现出更接近记忆T细胞的表型，并在慢性抗原刺激及肿瘤模型中展现出更优的治疗活性。

综上所述，scRNA-seq和scATAC-seq的联合分析在免疫研究中具有重要的应用前景，但仍存在一定的局限性：scATAC和scRNA-seq的数据合并是在非同一细胞的多组学数据整合中，需要借助生信软件整合注释，可能引入误差，影响后续数据分析的准确性。例如应用一文章，与scRNA-seq数据的注释结果相比，scATAC-seq未能注释到效应记忆T细胞（Tem）和记忆T细胞（Tmem），后续轨迹分析结果也存在略微差异。并且由于表观遗传和转录组数据来自不同细胞，细胞对应关系不一致，难以直接建立染色质开放状态与基因表达之间的因果关系。此外，不同实验批次带来的批次效应可能进一步增加数据整合的复杂性。

  寻因生物SeekOne® DD 单细胞  

  ATAC+RNA双组学  

寻因生物自主研发的商业化Seekone® DD 单细胞ATAC+RNA双组学以其独特的技术优势实现在一份细胞中同时完成ATAC-seq和RNA-seq，联合分析更准确、更具代表性。

  技术优势  

1、检测同一细胞中的mRNA和染色质可及性，将基因表达与潜在的调控功能相关联，从而能够实现更紧密、客观、真实的染色质开放性和基因表达的关系；

2、采用随机引物法进行转录组捕获，可检测更多非编码RNA，在数据分析维度增添新花样；

3、染色质可及性捕获引入UMI，避免PCR带来的丰度偏差；

4、细胞捕获数量达到与单细胞转录组测序相当的水平。

  数据展示  

参考文献：

[1] Daniel B, Yost KE, Hsiung S, et al. Divergent clonal differentiation trajectories of T cell exhaustion. Nat Immunol. 2022 Nov;23(11):1614-1627. doi: 10.1038/s41590-022-01337-5.

[2] Gur C, Wang SY, Sheban F, et al. LGR5 expressing skin fibroblasts define a major cellular hub perturbed in scleroderma. Cell. 2022 Apr 14;185(8):1373-1388.e20. doi: 10.1016/j.cell.2022.03.011.

[3] Jaeger-Ruckstuhl CA, Lo Y, Fulton E, et al. Signaling via a CD27-TRAF2-SHP-1 axis during naive T cell activation promotes memory-associated gene regulatory networks. Immunity. 2024 Feb 13;57(2):287-302.e12. doi: 10.1016/j.immuni.2024.01.011.