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科研热点 DNA 甲基化,究竟该如何追?

小雨 2019-03-14 19:01:44

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早在 1948 年 DNA 碱基的化学修饰就已经被检测到,上世纪 70 年代中期,Holiday 和 Pugh 提出了 5-甲基胞嘧啶在基因调控中的作用。可以毫不夸张的说,每一种 DNA 甲基化研究的检测方法都登顶过顶尖杂志。即使到现在,世界上依然有很多顶尖的实验室和公司在努力的革新甲基化研究的技术。今天小编就给大家详细介绍下全基因甲基化检测技术的前世今生。


一、全基因组甲基化检测技术

1、基于芯片平台的全基因组甲基化筛选

芯片平台作为目前比较成熟的筛选工具,已经在很多领域有了相应的应用。其中应用最为广泛的就 Illumina 平台和 Agilent 平台。

Methylation EPIC BeadChip 是全表观基因组关联研究(EWAS)的理想之选。它的覆盖范围,囊括 99% 的 RefSeq 基因,95% 的 CpG 岛,高覆盖度的增强子区域和其他内容类别,涵盖超过 90% 的 Infinium Human Methylation 450K 位点内容,能到达单碱基的分辨率,另外 Infinium 甲基化检测技术采用是单碱基延伸的原理,能特异性的识别甲基化位点。在 Methylation EPIC BeadChip 芯片中,同时采用了 Infinium Ⅰ 和 Infinium Ⅱ 探针设计,从而使得检测范围最大化。

2、基于测序平台的全基因组甲基化筛选

研究者将传统的 DNA 甲基化检测方法,如亚硫酸氢盐转化与高通量测序相结合,可以实现单碱基精度的甲基化图谱的构建。此外将成熟的 MeDIP 技术与二代测序相结合,可以快速有效地寻找基因组上的甲基化区域,从而比较不同细胞、组织、甚至疾病样本间的 DNA 甲基化修饰模式的差异。因此该技术也特别适用于大样本量的疾病表观研究。目前常见基于测序的甲基化研究技术包括:全基因组甲基化测序(WGBS), 安捷伦甲基化捕获测序(MC-seq),MeDIP-seq 和 RRBS。

不同平台全基因甲基化筛选的应用及特点分析,详见下表:


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二、特异性位点甲基化检测

1、甲基化特异性 PCR

灵敏度高,无需特殊仪器,经济实用,但是存在一定的局限性,预先需要知道待测片段的 DNA 序列,才能进行引物设计。另外,亚硫酸氢盐处理不完全则可能导致假阳性的出现。

2、亚硫酸氢盐测序 PCR

方法可靠,且精确度高,能明确目的片段中每一个 CpG 位点的甲基化状态,但要求克隆时所挑克隆较多,操作繁琐,不易大批量操作。另外,甲基化程度的定量依赖于挑选克隆的数目,因此这种方法只能算得上是一种半定量的技术方法。

3、焦磷酸测序

能够快速地检测甲基化的频率,对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测,在序列延伸过程中,根据 C 和 T 的掺入量来定量确定单个位点的 C-T 比例。因此,不同位点的甲基化变异就能被准确检测,并给出精确的甲基化程度的数据。目前来看,测序的片段长度还比较短,只有 100 多 bp,其中有效长度约为 60bp。

4、质谱检测

该技术基于碱基特异性裂解可进行全基因组甲基化水平及特定 CpG 位点甲基化状态的检测。检测量可低至 20ng、检测长度 200~600bp、可确定单一位点甲基化程度、灵敏度可低至 5%。但是质谱检测的实验较复杂,具有耗时且人为干预程度高等缺点。


三、甲基化检测技术新进展

由于亚硫酸氢盐对 DNA 的降解率达 99%,目前科学家们试图能够发明一种基于酶处理的办法区分出 5-甲基胞嘧啶和 5-羟甲基胞嘧啶。


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2019 年,牛津大学路德维格癌症研究所两位科学家在 Nature Biotechnology 发表文章,报道了一种新的 DNA 甲基化检测方法:TET 辅助吡啶硼烷测序(TET-assisted pyridine borane sequencing, TAPS)。

TAPS 方法包括两个步骤:首先利用 TET 酶将 5mC 和 5hmC 转化为 5-羧基胞嘧啶,然后将 5caC 转化为胸腺嘧啶,就可以通过普通测序仪测序。


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TAPS 检测原理示意图[1]


针对 WGBS 所带来的比对率低和序列比对准确性差两大问题,于文强教授(伯豪生物院士专家工作站专家)团队开发出了一种新的全基因组检测的方法 GPS。该方法利用 T4DNA 聚合酶的 3′-5′外切酶活性和 5′-3′聚合酶活性,使得双端测序的一端是基因组原序列,另一端是转化后的表观序列。该方法极大提高了比对效率和准确性。


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GPS 流程示意图[2]


2010 年,芝加哥大学何川教授团队在 Nature Biotechnology 上发表了一种采用化学标记检测 5-羟甲基胞嘧啶的新方法。他们使用 T4 噬菌体 b-糖苷转移酶将含有叠氮化物基团的工程糖基转移到 5-hmC 的羟基上。叠氮基团可以通过生物素进行化学修饰,用于哺乳动物基因组中 5-hmC DNA 片段的检测、亲和富集和测序[3]

2012 年,何川教授团队在 Cell 杂志上报道了一种可以单碱基检测 5-羟甲基胞嘧啶的方法。该方法结合了 TET 酶的处理和亚硫酸氢盐处理。在开始阶段,在 β-葡萄糖基转移酶的作用下催化葡萄糖转移到 5-hmC 上生成 β-葡糖糖基-5-hmC(5-gmC)。 5-gmC 的生成可以避免 5-hmC 被 TET 氧化成 5-caC,同时所有的 5-mC 会被 TET 氧化成 5-caC。随后,在亚硫酸氢盐的处理下,所有的 C 和 5-caC 都被转化成 U 和 5caU,结合二代测序 5-gmC 仍然为 C[4]


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T4 噬菌体 b-糖苷转移酶结合生物素标记检测 5-hmC

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单碱基检测 5-hmC 的技术流程图


来源:生物学霸

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