靶点结合（Target Engagement）是贯穿药物研发全流程的核心验证指标，其通过精准量化药物-靶点相互作用特性，显著提升研发成功率并降低风险。本文系统梳理了靶点结合检测技术选择框架，为临床前研究提供关键决策支持，助力实现理性、高效的药物开发。由于文章篇幅较长，为了避免阅读疲劳，将分多期发表。

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  早期药物研发中的靶标结合（Target Engagement）（一）

  本文所述热分析技术的特征在于涉及温度变化。这包括使用量热法（ITC和DSC）的技术，以及观察蛋白质熔解温度（TM）的方法（DSC、DSF、CETSA、InCELL Pulse、DLS和CD），或是利用热泳迁移率变化（MST）或染料在不同温度下荧光变化（TRIC）的技术。热分析方法基于溶液体系，不需要将靶点或配体固定在载体表面。这使得它们易于建立并适用于多种不同体系。

  热位移分析（TSA）作为差示扫描荧光法（DSF）的一种类型，是最常用的热分析筛选技术，细胞热转移分析（CETSA）也已被开发出来。等温滴定量热法（ITC）和差示扫描量热法（DSC）可用于测定焓值，但由于通量较低，因此更适合用于苗头化合物的验证和表征。

  2.1 等温滴定量热法（ITC）

  配体与靶点结合时会伴随焓变，导致向周围溶液释放或吸收热量。这种温度变化可通过等温滴定量热法进行测量。ITC是一种非常简单的技术，不需要固定化或标记，只需将蛋白质和配体溶于溶液中。该方法无需进行检测方法开发，因此能快速获得配体结合的热力学数据。

  在ITC实验中，两个样品池被置于绝热屏蔽层中以最小化热交换（图3a）。其中，样品池含有蛋白质溶液，参比池则装有缓冲液。两个池子初始被加热至相同温度。在搅拌条件下，将配体等分试样依次加入样品池的蛋白质溶液中，引起温度变化。当样品池温度发生变化时，系统会调节加热功率直至样品池与参比池温度重新达到平衡。最初加入配体时温度变化显著，因为所有加入的分析物都会结合；随着继续加入配体，温度变化逐渐减小，表明蛋白质趋于饱和。该过程持续进行直至不再观察到温度（及功率）变化，说明蛋白质已完全被配体饱和。

Figure 3. a) Setup of an ITC experiment. Aliquots of ligand are added to a solution of protein, this causes an exotherm which is measured. Further ligand aliquots are added until saturation of the protein is reached. b) Raw data from an ITC experiment showing spikes in power caused by temperature changes on addition of each aliquot of analyte. c) Plot of the integrated enthalpy values per injection allows stoichiometry and thermodynamic parameters to be determined.

  ITC检测的原始数据是随时间变化、维持参比池与样品池之间ΔT=0所需功率的曲线图（图3b）。每次加入等分试样时，两池间的温差会先达到峰值，随后返回基线。值得注意的是，若结合过程为吸热反应，系统提供的功率将会增加。这些峰下的面积代表每次注入的焓变值，将其对蛋白质：配体（P:L）摩尔比作图，即可确定热力学常数、化学计量比以及结合的总焓变（图3c）。

  ITC是直接结合测量的金标准，但尽管量热仪的灵敏度有所提升，该方法仍需要毫克级的蛋白质和高溶解度的化合物。它尚未应用于基于细胞的分析，且通量较低，因此无法用于筛选工作。尽管如此，ITC仍是用于苗头化合物二次确认和详细表征的有用技术，包括对三元复合物的研究。

  2.2 差示扫描量热法（DSC）

  当蛋白质被加热时，它们最终会达到一个发生解折叠（变性）的转变点。蛋白质折叠态与解折叠态比例为50:50时的温度被称为熔解温度（TM）。这一过程会破坏蛋白质结构中的分子内键，从而产生放热现象。在DSC中，蛋白质样品经受温度梯度变化，记录在熔解温度时发生的放热现象。

  DSC需要两个密封的样品池：一个样品池和一个参比池，它们在加热炉中逐渐升温（图4）。然后测量样品池和参比池之间的温差。为了通过质量标准化数据，使用焓变来计算过量热容（样品减去参比），并将其对温度作图（图4b）。当发生相变时（在本例中是蛋白质的解折叠），在转变温度会释放热量（放热）。这使得能够确定起始温度（Tonset）、熔解温度（TM）以及转变的焓变（即曲线下面积）。通过在配体存在下重复该实验，可以确定熔解温度和焓的变化，稳定性更强的配体会使TM有更大的提高。与ITC类似，DSC的灵敏度多年来有所提高，但其通量仍然较低，因此不适用于化合物筛选。

Figure 4. a) Setup for a differential scanning calorimetry experiment. A cell containing protein and ligand is gradually heated and exotherms are monitored compared to a buffer solution. b) Data from a DSC experiment is normalized heat capacity (sample minus reference) vs temperature. Exotherms with or without ligands can be compared.

  2.3 差示扫描荧光法（DSF）

  DSF是通过监测温度变化时的荧光信号来检测蛋白质熔解温度（TM）的技术。该方法可通过观察蛋白质解折叠时产生的荧光变化来测定TM，这种荧光变化可以来自蛋白质自身荧光（Nano-DSF）或外加染料（热位移分析）。当配体与蛋白质结合时，由于有利的分子间相互作用通常会产生稳定化效应，导致TM升高。配体结合越强，稳定化程度越高，TM的变化也越大。配体也可能引起去稳定化效应，表现为TM降低。与DSC类似，DSF不能用于确定KD值，因为影响TM的因素众多。尽管DSF提供的信息有限，但在检测蛋白质稳定性变化方面仍非常有用，可用于筛选具有广泛亲和力的化合物，单个板每小时通量高达1536个配体。

    2.3.1 Nano-DSF

    若目标蛋白含有色氨酸或酪氨酸残基，则具有天然荧光，该荧光会在蛋白质变性时发生变化。通过加热，可使用荧光计测量这种固有荧光的变化，从而确定熔解温度，这种方法称为纳米DSF。

    2.3.2 热位移分析（TSA）

    对于缺乏天然荧光或荧光变化较小难以观察的蛋白质，可添加荧光染料来测定TM。染料的荧光特性必须在蛋白质折叠或解折叠状态下表现出差异（图5a）。热位移分析的优点在于操作相对简单，仅需蛋白质和染料即可，避免了昂贵生化试剂的高成本。该方法还可使用标准热循环仪（实时荧光定量PCR仪）来监测温度相关的荧光变化。

Figure 5. a) Structure and function of dyes used in TSA. b) Data from a TSA experiment. Fluorescence increases as the protein unfolds; a slight decrease is observed as proteins begin to aggregate at higher temperatures.

  TSA实验的直接读数是一个荧光强度随温度变化的曲线图（图5b）。当使用在蛋白质解折叠状态下荧光增强的染料（如Sypro Orange）时，随着蛋白质解折叠，荧光强度会随温度升高而增加。当所有蛋白质都解折叠时，荧光强度达到最大值。在更高温度下，蛋白质聚集会导致染料解离，使荧光输出略微下降。蛋白质50%发生变性时的温度即为TM。该实验在不同浓度的配体存在下重复进行，记录熔解温度的变化（即热位移ΔTM）。

  热位移分析可以进行微型化改造用于化合物筛选。这种方法特别有用，因为其具有通用性，且仅需了解蛋白质结合特性而无需掌握其功能的详细信息。由于其高灵敏度，TSA非常适合用于基于片段的药物发现（FBDD）。

  2.4 细胞热转移分析（CETSA）

  2013年，Martinez Molina及其同事首次开发了在细胞内测量热位移（ΔTM）的实验方法。CETSA通过定量检测热激处理后细胞内残留的折叠蛋白量来测量药物-靶标相互作用。该数值与靶蛋白的熔解温度（TM）相关，而TM可受配体与蛋白结合亲和力程度的影响。在开创性案例中，完整细胞或细胞裂解液被加热至一系列温度，随后通过离心去除聚集蛋白，残留的可溶性折叠蛋白则通过蛋白质印迹法进行检测（图6）。

Figure 6. Workflow of CETSA. Cells incubated with ligand are heated to various temperatures and the amount of intact protein of interest remaining is analyzed.

  CETSA技术的进一步发展已使其检测手段趋于多元化。除蛋白质印迹法外，目前还可采用质谱分析、Alpha-LISA及HiBit（BiTSA）标记等多种检测方法。多个研究团队已成功运用不同蛋白质检测策略，将CETSA应用于化合物库筛选。该技术不仅能用于活细胞膜蛋白研究，还可拓展至体内或离体实验体系。

  2.5 InCELL Pulse与InCELL Hunter技术

  2017年，Eurofins DiscoverX公司报道了两种细胞靶点结合检测技术——InCELL Pulse和InCELL Hunter。与CETSA类似，InCELL Pulse通过检测热激处理后完整蛋白的残留量来评估配体稳定作用（配体存在时可增加蛋白热稳定性，见图7a）。而InCELL Hunter则基于稳态条件下监测蛋白质合成、积累与降解的动态平衡（图7b），其原理在于配体通过稳定靶蛋白，使完整蛋白的累积浓度高于无配体状态。该技术要求靶蛋白需具有较短半衰期，以确保能在实验时间窗内观察到配体介导的稳定化效应。

Figure 7. InCell Pulse and InCell Hunter assays. a) For InCell Pulse, the amount of intact protein present after heat shock is measured. b) For InCell Hunter, the steady-state concentration of intact protein in its natural cycle of synthesis, accumulation and proteolysis is measured. c) Both assays require the protein to be tagged with an enzyme donor which at the end of the assay can be complimented by an enzyme acceptor portion to form a catalytically active enzyme which turns over a chemiluminescent substrate.

  在这两种检测方法中，完整蛋白的含量均通过酶片段互补（Enzyme Fragment Complementation, EFC）技术结合化学发光法进行定量（图7c）。为实现这一检测，InCELL系列技术需要在细胞表达目标蛋白前，先将酶片段标记至目标蛋白上。实验完成后，通过添加互补酶片段来检测完整蛋白含量——当互补片段与标记的酶片段结合时，会形成具有催化活性的β-半乳糖苷酶，该酶可转化化学发光前体底物并产生光信号。若样品中不存在完整折叠蛋白，则酶片段无法与互补部分结合，导致无法生成发光化合物且无光信号产生。研究证实，InCELL Pulse和InCELL Hunter均适用于化合物筛选。

  2.6 动态光散射技术（DLS）

  蛋白质在聚集态时比天然折叠状态具有更强的光散射特性，这一现象可通过光散射技术进行检测。光散射测量可分为静态（SLS，在特定时间点测量多角度或浓度下的散射）和动态（DLS，随时间变化测量单角度或多角度散射）两种技术。在DLS实验中，激光照射蛋白质溶液（图8a）后，系统会记录散射光强度随时间的变化（图8b）。这些原始数据经过处理后，可得到样品中颗粒大小的分布情况。为测定蛋白质的熔解温度（TM），实验过程中会对样品进行加热，并实时监测光散射信号的变化。

Figure 8. DLS of protein–ligand complexes in solution. a) A laser beam is scattered by freely rotating proteins in solution and the intensity is measured by a detector. b) Different sized particles will have distinctive scattering intensity vs time profiles.

    由于DLS可实时监测蛋白质的聚集（即热变性）过程，该技术也适用于评估配体对蛋白质的热稳定作用。虽然DLS已被用于化合物筛选，但与差示扫描荧光法（TSA）相比，其灵敏度较低，仅能检测到超过0.5°C的TM变化。此外，DLS是鉴定小分子或蛋白质聚集现象的有效工具，这类聚集常导致筛选实验出现假阳性结果。

  2.7 圆二色光谱技术（CD）

  蛋白质的热解折叠过程还可通过圆二色光谱和吸收光谱进行检测（67）。CD技术通过测量左旋与右旋圆偏振光的吸收差异来分析蛋白质构象。由于蛋白质具有明确的手性结构，会产生显著的CD信号；而当其变性时，肽键的自由旋转会导致CD信号减弱。在CD实验中，单色圆偏振光（左旋或右旋）穿过蛋白质样品（图9a），系统记录两种偏振光的吸收差值（图9b）。通过在不同温度下重复测试，可绘制温度-蛋白解折叠率曲线，进而对比配体存在与否对蛋白热稳定性的影响。

Figure 9. CD of protein–ligand complexes in solution. a) The difference in absorbance in left or right polarized light after passing through a sample is detected. b) The results from a CD experiment are CD (θ) versus wavelength, unfolded proteins will give a weaker signal.

  尽管高通量CD系统正在研发中，但其在配体筛选方面的应用尚未完全实现。

  2.8 微量热泳动技术（MST）

  MST利用热泳动迁移率原理，即溶液中分子在温度梯度下的定向移动现象，该移动受分子大小、电荷及水化层影响。该技术于2011年首次开发，通过监测蛋白质或蛋白质-配体复合物溶液在红外激光加热点扩散时的局部荧光变化来工作。配体结合会改变蛋白质的热泳动特性，因此MST可用于测定解离常数（KD）。但需注意，MST信号的主要贡献可能来自分子随温度升高导致的荧光衰减效应，这与TRIC检测原理类似。

    进行MST实验时，需将蛋白质溶液与不同浓度配体装入毛细管。通过红外激光依次诱导各毛细管产生局部温差（ΔT），从而引起分子浓度分布变化。通过检测蛋白质自身荧光或标记荧光基团的信号（图10a），可确定加热区域的蛋白质浓度分布。

Figure 10. a) Setup of an MST experiment. Capillaries of varying ligand concentrations are scanned with an IR laser and fluorescence is monitored. Thermophoretic mobility is the movement of molecules across a temperature gradient, which is induced by an IR laser in MST. b) Data from an MST experiment. As the laser is switched on, fluorescence decreases as proteins diffuse away from the detector, when the laser is turned off, proteins gradually diffuse back.

  MST实验的检测信号是荧光随时间的变化。当开启红外激光时，随着蛋白质分子扩散离开加热区域，荧光强度会降低（图10b）。关闭激光后，随着分子沿浓度梯度回扩散，荧光信号会回升。当存在结合配体时，蛋白质的运动方式会发生改变。为了测定结合亲和力，需将归一化荧光强度对配体浓度作图。通过分析MST曲线的形状，还可以获得有关蛋白质聚集和变性的信息。

  MST技术的一个主要缺点是蛋白质通常不具备足够的天然荧光，因此需要在蛋白质上标记荧光基团。此外，由于不同分子在MST中的响应可能存在差异，该方法不适合采用固定阈值判断结合的初级筛选。为克服这一局限，可采用竞争结合实验。研究表明，MST具有足够的灵敏度，可检测片段分子的弱结合作用。该技术还具有样本需求量低的优势（毛细管样品量可少于4μL），并能用于细胞裂解液和去垢剂等复杂体系。

  2.9 温度相关荧光强度变化（TRIC）技术

  TRIC检测技术的原理是基于连接在靶蛋白上的荧光染料分子会随温度升高（通常表现为荧光减弱）而发生荧光强度变化（图11a）。这种荧光随温度变化的特性受染料微环境影响，因此可通过监测荧光变化来追踪配体与靶蛋白的结合情况。该现象构成了MST信号的主要组成部分，其实际操作流程与MST技术高度相似：均采用红外激光加热样品并实时监测荧光变化（图11b）。

  与必须使用毛细管的MST技术不同，TRIC检测可在微孔板中进行，显著提高了通量。研究证实该技术具有适用于片段化合物筛选的灵敏度。

Figure 11. a) Principle of a TRIC assay, changing the temperature influences the fluorescence of a dye tethered to a protein. b) In a TRIC experiment, sample solutions are heated with an IR laser and the fluorescence in the presence of differing ligand concentrations is measured in real time.

前篇链接：

早期药物研发中的靶标结合（Target Engagement）（一）

  本文主要内容来源于JMC文章，由于篇幅比较长，将分成多个部分（其中本部分为第二部分），每个部分聚焦一类技术，希望为药物研发科学家提供一个全面的工具集合，在项目研发中选择使用。

Refenrence：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.4c03115