█ 导语 .

  自身免疫性心肌炎（EAM）如同隐匿于体内的危险“暗礁”，严重威胁生命健康，而有效的治疗手段却似迷雾中的灯塔，难寻踪迹。羟氯喹（HCQ），这位在风湿性疾病治疗中战绩斐然的“老将”，能否在 EAM 的“战场”上崭露头角？

  2025年4月13号，华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科汪道文团队在《British Journal of Pharmacology》发表题为《Hydroxychloroquine cures autoimmune myocarditis by inhibiting the innate immune system via the C-X-C motif chemokine ligand 16 and C-X-C motif receptor 6 axis between macrophages and T cells》的研究论文。本文以小鼠为研究对象，通过构建 EAM 模型，综合利用超声心动图、组织染色、流式细胞术、单细胞 RNA 测序等技术，深度解析 HCQ 对 EAM 的治疗效果及其作用机制，尤其聚焦于巨噬细胞与 T 细胞间 CXCL16/CXCR6 轴的调控路径。该研究不仅为揭示 EAM 的发病机制提供新视角，更为临床治疗 EAM 开辟了潜在的药物应用方向，对改善患者预后具有重要意义。

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  英文标题：Hydroxychloroquine cures autoimmune myocarditis by inhibiting the innate immune system via the C-X-C motif chemokine ligand 16 and C-X-C motif receptor 6 axis between macrophages and T cells

  中文标题：羟氯喹通过巨噬细胞和T细胞之间的CXCL16和CXCR6轴抑制先天免疫系统治疗自身免疫性心肌炎

  发表期刊：British Journal of Pharmacology

  影响因子：6.8

  发表时间：2025年4月13号

  DOI：10.1111/bph.70028

技术路线图

● 1.羟氯喹干预有效改善急性心肌炎

  通过构建急性实验性自身免疫性心肌炎（EAM）小鼠模型，评估羟氯喹（HCQ）对心脏功能和炎症的治疗效果。（图 a）呈现了急性心肌炎模型中 HCQ 的干预框架，即在免疫诱导心肌炎后（第 0 天和第 7 天），于第 8-14 天给予 HCQ 灌胃，并在第 21 天评估疗效。（图 b）通过超声心动图显示，与对照组相比，EAM 小鼠心脏结构异常，而 HCQ 治疗显著改善了左心室射血分数（LVEF，图 c）、左心室缩短分数（LVFS，图 d）和 E/A 比值（图 e），提示心脏收缩和舒张功能的恢复。心导管检测进一步表明，HCQ 提高了左心室最大压力上升速率（dp/dt Max，图 f），并改善了最小压力上升速率（dp/dt Min，图 g），证实其对心脏收缩功能的增强作用。（图 h-i）显示，HCQ 治疗显著降低了左心室前壁在收缩期和舒张期的厚度，提示减轻了心室壁的炎症性水肿。

  组织学分析方面，（图 j）HE 染色显示 EAM 小鼠心肌炎症细胞浸润显著，而 HCQ 治疗减少了炎症细胞聚集；天狼星红染色（图 j）和定量分析（图 k）表明，HCQ 显著降低了心肌纤维化面积。免疫荧光染色（图 l-m）显示，HCQ 治疗组心脏中的巨噬细胞（F4/80+）、中性粒细胞（MPO+）和 T 细胞（CD3+）浸润量较 EAM 组明显减少。血浆细胞因子检测（图 n）显示，HCQ 显著降低了促炎因子 IL-1β 和 IL-6 的水平，但对 IL-10 和 TNF-α 无显著影响。综上，通过多维度检测，证实HCQ 可改善急性心肌炎小鼠的心脏功能，减轻炎症细胞浸润和纤维化，其疗效与抑制系统性炎症反应密切相关。

图1羟氯喹干预有效改善急性心肌炎

● 2. 单细胞测序分析显示HCQ降低巨噬细胞趋化活性

  为了揭示了羟氯喹（HCQ）对心肌炎中免疫细胞趋化活性的调控机制。通过图 a 所展示的实验设计流程，即对短期 HCQ 处理的心肌炎小鼠心脏非心肌细胞进行单细胞 RNA 测序（scRNA-Seq），具体包括对照组、HCQ 组、EAM 组和 EAM+HCQ 组共 4 个组别，最终从 4 组样本中捕获 34,541 个高质量细胞。利用UMAP聚类技术，将单细胞样本分为 11 个非心肌细胞亚群，包括巨噬细胞、T 细胞、中性粒细胞等（图 b）。定量分析显示，HCQ 处理显著降低了心肌炎小鼠心脏中炎症细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞、T 细胞）的比例和数量，提示其抑制炎症浸润的作用（图 c）。炎症评分和细胞因子评分的比较表明，HCQ 处理组的炎症相关基因表达显著低于心肌炎组，进一步支持其抗炎效应（图 d）。Reactome 富集分析发现，HCQ 下调的基因显著富集于先天免疫、趋化因子受体结合等信号通路，暗示其通过抑制免疫细胞趋化发挥作用（图 e）。流式细胞术检测血液中炎症细胞数量显示，HCQ 减少了循环中的 neutrophils、 monocytes、 macrophages 和 lymphocytes，但对骨髓和脾脏中的免疫细胞数量无显著影响，提示 HCQ 特异性抑制免疫细胞向心脏的趋化迁移（图 f）。基因集变异分析（GSVA）显示，心肌炎模型中巨噬细胞和中性粒细胞的趋化能力最强（图 g），而 HCQ 主要抑制巨噬细胞的趋化相关基因表达（图 h）。GO富集分析表明，HCQ 处理后巨噬细胞中与 “细胞趋化性” 相关的信号通路显著下调（图 i）。通过 CellChat 分析配体 - 受体相互作用网络发现，心肌炎中巨噬细胞通过 CXCL 和 CCL 通路增强对 T 细胞、NK 细胞等的趋化作用，而 HCQ 显著减弱了 CXCL16-CXCR6 等关键趋化轴的相互作用强度（图 j）。ELISA 检测显示，HCQ 选择性下调巨噬细胞分泌的 CXCL1、CXCL10、CCL2 等趋化因子，而对中性粒细胞来源的趋化因子影响较小（图 k）。综上，从单细胞水平证实 HCQ 通过抑制巨噬细胞的趋化活性和 CXCL/CCL 信号通路，减少免疫细胞向心脏的募集，从而缓解心肌炎症。

图2 单细胞测序分析显示HCQ降低巨噬细胞趋化活性

  ● 3. HCQ通过抑制巨噬细胞源性CXCL16抑制Th17和NKT细胞浸润

  通过分析心肌炎小鼠巨噬细胞中上调基因与 HCQ 处理后下调基因的交集，发现 CXCL16 是唯一属于 C-X-C 趋化因子家族且位列前 10 的下调基因，提示其在 HCQ 作用中的关键地位（图 a）。蛋白质印迹结果显示，与对照组相比，心肌炎模型（EAM）小鼠心脏组织中 CXCL16 蛋白水平显著升高，而 HCQ 处理后该蛋白表达明显降低（图 b）。ELISA 检测血清中 CXCL16 浓度显示，HCQ 治疗组小鼠血清 CXCL16 水平较 EAM 组显著下降，表明 HCQ 可抑制 CXCL16 的系统性释放（图 c）。免疫荧光染色显示，CXCL16 主要与巨噬细胞标记物 F4/80 共定位，而与心肌细胞（cTnI）、成纤维细胞（vimentin）、内皮细胞（CD31）、中性粒细胞（MPO）及 T 细胞（CD3）无明显共定位，证实 CXCL16 主要由巨噬细胞表达（图 d）。单细胞 RNA 测序（scRNA-Seq）分析显示，CXCL16 在巨噬细胞各亚群（如 M1、M2、M3、M5）中均有表达，而 HCQ 处理后这些亚群的 CXCL16 水平均显著下调（图 e）。配体 - 受体相互作用分析表明，HCQ 显著减弱了巨噬细胞与 T 细胞、NKT 细胞之间的 CXCL16-CXCR6 信号轴相互作用，提示其通过阻断趋化通路发挥作用（图 f）。免疫荧光染色及定量分析显示，HCQ 处理后心脏组织中 Th17 细胞（CD3+IL-17A+）和 NKT 细胞（integrin α2+CD3+）的浸润数量较 EAM 组显著减少，进一步证实 HCQ 通过抑制 CXCL16 介导的免疫细胞招募减轻心肌炎症（图 g、h）。综上，从基因表达、细胞定位、分子互作及细胞浸润多个层面，阐明了 HCQ 通过抑制巨噬细胞 CXCL16 表达、阻断 CXCL16-CXCR6 轴进而减少 Th17 和 NKT 细胞浸润的机制。

图3 HCQ通过抑制巨噬细胞源性CXCL16抑制Th17和NKT细胞浸润

  ● 4. HCQ通过抑制CXCL 16-CXCR 6轴发挥其作用

  通过 ELISA 检测发现，心肌炎小鼠心脏匀浆中 CXCL16 蛋白浓度显著升高，而 HCQ 处理后其水平明显降低，提示 HCQ 可能减少 CXCL16 的分泌（图 a）。Transwell 实验表明，心肌炎小鼠心脏匀浆对 Th17 细胞和 NKT 细胞的趋化能力显著增强，而 HCQ 处理或加入 CXCL16 中和抗体（NAbs）后，这种趋化能力被显著抑制，且两者效果相似，暗示 HCQ 的作用依赖于 CXCL16（图 b、c）。在体外培养的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中，LPS 刺激显著增加 CXCL16 的分泌并增强对 Th17/NKT 细胞的趋化能力，而 HCQ 预处理可剂量依赖性地抑制 CXCL16 分泌及趋化活性，进一步证实 HCQ 通过调控巨噬细胞功能发挥作用（图 d-f）。通过腺病毒敲低巨噬细胞中的 CXCL16（Ad-shCXCL16），其培养上清液中 CXCL16 水平显著降低，且对 Th17/NKT 细胞的趋化能力明显减弱，直接证明 CXCL16 是介导免疫细胞迁移的关键因子（图 g-i）。使用 CXCR6 受体抑制剂 ML339 处理后，Th17/NKT 细胞的迁移能力被有效阻断，表明 CXCL16 需通过结合 CXCR6 发挥趋化作用（图 j、k）。当直接在 Transwell 系统中加入 HCQ 作用于 T 细胞时，其迁移能力未受影响，排除了 HCQ 对 T 细胞的直接作用，确认其通过抑制巨噬细胞来源的 CXCL16 间接发挥效应（图 l、m）。综上，从体内外实验多角度证实，HCQ 通过抑制巨噬细胞分泌 CXCL16，阻断 CXCL16-CXCR6 轴介导的 Th17 和 NKT 细胞趋化，从而减轻心肌炎症损伤。

图4 HCQ通过抑制CXCL 16-CXCR 6轴发挥其作用

  ● 5. HCQ通过YY1调节CXCL16的表达

  为了进一步研究HCQ对CXCL16的影响，评估了EAM小鼠心脏和LPS刺激的BMDM中CXCL16的mRNA水平，观察到在心肌炎小鼠心脏组织及脂多糖（LPS）刺激的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中，CXCL16 的 mRNA 水平显著升高，而 HCQ 处理可显著下调其表达（图 a、b）。通过转录因子预测工具（图 c），筛选出 YY1、CREB1 和 MYC 作为潜在调控因子，其中 YY1 在心肌炎模型中表达变化最显著 ——（图 d、e）显示心肌炎小鼠心脏中 YY1 的 mRNA 和蛋白水平均升高，HCQ 处理后显著降低；在 LPS 刺激的 BMDMs 中也观察到类似趋势，且 CREB1 和 MYC 的表达无明显变化（图 f、g）。进一步通过功能实验验证，敲低 YY1 可减少 BMDMs 中 CXCL16 的分泌（图 h），而过表达 YY1 则逆转 HCQ 对 CXCL16 的抑制作用（图 i），表明 YY1 是 CXCL16 的关键上游调控因子。机制上，双荧光素酶报告基因实验显示，YY1 可结合 CXCL16 启动子的特定区域（-1863 至 - 1856 bp），突变该结合位点后荧光素酶活性显著降低（图 j）； ChIP-qPCR 实验进一步证实 YY1 与该区域直接结合（图 k）。综上，HCQ 通过抑制巨噬细胞中 YY1 的表达，减少其与 CXCL16 启动子的结合，从而下调 CXCL16 的转录，阻断 CXCL16-CXCR6 轴介导的免疫细胞趋化，为心肌炎治疗提供了分子机制层面的理论依据。

图5 HCQ通过YY1调节CXCL16的表达

  ● 6. 靶向CXCL16的抗体的中和减轻了心肌炎的严重程度

为了探讨了靶向 CXCL16 的中和抗体对心肌炎的治疗作用。设计以下实验，即在心肌炎模型小鼠中，从第 8 天起每 2 天腹腔注射 CXCL16 中和抗体（NAbs），共 3 次，对照组注射 IgG（图 a）。心脏功能检测显示，CXCL16 NAbs 显著改善了左心室射血分数（LVEF）、左心室缩短分数（LVFS）、E/A 比值等超声心动图参数（图 b-e），心导管测量的左心室最大压力上升速率（dp/dt Max）和最小压力上升速率（dp/dt Min）也表明心脏收缩和舒张功能得到提升（图 f）。组织学分析中，HE 染色显示心脏炎症细胞浸润减少，天狼星红染色显示纤维化面积缩小（图 g-h），qPCR 结果进一步表明心脏组织中 IL-1β、IL-6、TNF-α 等促炎细胞因子的 mRNA 水平显著降低（图 i）。免疫荧光染色（图 j-k）显示，CXCL16 NAbs 减少了心肌组织中 Th17 细胞（CD3+IL-17A+）和 NKT 细胞（integrin α2+CD3+）的浸润。综上，中和 CXCL16 可通过抑制炎症细胞募集和减轻炎症反应，改善心肌炎小鼠的心脏功能并缓解心肌损伤，提示 CXCL16 是治疗心肌炎的潜在靶点。

图6 靶向CXCL16的抗体的中和减轻了心肌炎的严重程度

   研究结论 

  1. 羟氯喹通过抑制巨噬细胞中 YY1-CXCL16 通路阻断免疫细胞趋化：羟氯喹（HCQ）通过下调巨噬细胞中的转录因子 YY1，抑制 C-X-C 基序趋化因子配体 16（CXCL16）的表达，阻断 CXCL16 与其受体 CXCR6 的相互作用，从而减少 Th17 细胞和自然杀伤 T 细胞（NKT）向心肌组织的趋化迁移，减轻炎症反应。

  2. 羟氯喹显著改善心肌炎小鼠的心脏功能并减轻病理损伤：在急性和慢性实验性自身免疫性心肌炎（EAM）小鼠模型中，HCQ 治疗显著改善心脏收缩和舒张功能（如提高左心室射血分数 LVEF、左心室缩短分数 LVFS），减少心肌炎症细胞浸润（巨噬细胞、T 细胞等）和纤维化面积，并降低促炎因子（如 IL-1β、IL-6）水平。

  3. 靶向 CXCL16-CXCR6 轴具有治疗心肌炎的临床转化潜力： CXCL16 中和抗体可模拟 HCQ 的保护效应，有效改善心肌炎小鼠的心脏功能并减轻炎症，证实 CXCL16-CXCR6 轴是治疗心肌炎的关键靶点。HCQ 作为已获批药物，其在心肌炎中的疗效为临床转化提供了潜在策略。

  参考文献：

  [1] Xuan Y, Gao X, Wang J, Li H, Zhou Z, Liao M, Wen Z, Wang DW. Hydroxychloroquine cures autoimmune myocarditis by inhibiting the innate immune system via the C-X-C motif chemokine ligand 16 and C-X-C motif receptor 6 axis between macrophages and T cells. Br J Pharmacol. 2025 Apr 13. doi: 10.1111/bph.70028. Epub ahead of print. PMID: 40222951.