大家好，欢迎来到今天的文献解读时间！今天我们要聊的是一篇关于肝脏再生的研究，题目是Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration。听起来是不是有点高大上？别担心，我们会用最接地气的方式来解读这篇“肝”货满满的论文。

  想象一下，如果你的肝脏突然失去了三分之二的质量，你会怎么办？别慌，肝脏可是个“再生小能手”，它能在几天内恢复到原来的大小和功能！那么这么精妙的过程是如何调控的呢？今天要分享的这项研究就是通过联合单细胞RNA测序和ATAC测序，深入探讨了肝细胞在再生过程中的再生能力。

  简单来说，研究人员发现，肝细胞在再生过程中会分化成多个不同的“小分队”，有的继续保持成熟肝细胞的功能，有的则“返老还童”，变得像胚性肝细胞一样。这些“返老还童”的肝细胞不仅激活了与再生相关的信号通路，还表现出胚性肝细胞特有的染色质景观。听起来是不是有点像科幻电影里的情节？别急，接下来我们会一步步拆解这篇论文，看看科学家们是如何通过单细胞技术，揭开肝脏再生的神秘面纱的。准备好了吗？让我们一起踏上这场“肝”细胞的奇妙冒险吧！

  研究背景与目的  

  肝脏具有极强的再生能力，可在切除70%体积后快速恢复功能与质量，但其在再生过程中如何平衡增殖需求与代谢功能的维持仍不清楚。本研究通过整合单细胞转录组（scRNA-seq）和染色质可及性分析（snATAC-seq），解析了小鼠部分肝切除（PHx）后肝细胞的动态异质性，揭示了再生过程中表观遗传重塑与功能分化的分子机制。

  创新技术应用  

  RNA Velocity：预测肝细胞状态转变轨迹。

  SCENIC与chromVAR：解析转录因子调控网络及染色质可及性motif富集。

  主要研究内容  

  1. scRNA-seq揭示肝细胞在肝脏再生过程中的异质性

  为了填补肝细胞群体如何在显著增加复制活性的同时维持肝脏特异性功能这一知识空白，作者从4只健康成熟雄性小鼠和4只在48小时前接受PHx的小鼠中分离了肝细胞。在这两组中，分别从3个样本提取RNA或细胞核，用于bulk RNA-seq或bulk ATAC-seq，产生3个生物学重复；每组的第4个样本一分两半，一半细胞用于生成scRNA-seq文库，另一半提取细胞核进行snATAC-seq（图1A）。基于图形的无监督聚类识别出9个簇，命名为r1–r9，每个簇包含27-438个细胞（图1B）。UMAP图形显示，再生肝脏中的大多数细胞共同表达静脉周围和门静脉周围特征（图1C）。

图1 单细胞分辨率再生肝细胞转录组定位

  2. 肝细胞在再生挑战后分化为功能多样化的亚群

  比较两组scRNA-seq数据，检测PHx后肝细胞中发生的特征变化。经过严格过滤，作者从未受损的肝脏中获得了1196个肝细胞，并将它们与再生肝脏进行比较，以评估已知对肝脏再生至关重要的基因表达变化。正如预期，关键的细胞周期调节因子和其他增殖基因，包括编码小鼠肝脏再生所需受体的基因Tnfrsf12a，在PHx后增加（图1D）。功能基因表达分析显示，这些肝细胞在转录上是异质的。事实上，scRNA-seq分析表明，尽管所有再生细胞簇都显示出高水平的肝细胞特异性基因表达（图1E），但根据转录相似性进行的进一步层次聚类可以将细胞分为3个主要组（Group A/B/C；图1F）。Group A（ r1, r2, r4, r5, r6），与小分子生物合成、单羧酸代谢、类固醇代谢和药物代谢有关；Group B（r3, r9），与高受体酪氨酸激酶信号传导、RNA剪接、翻译起始、Rho GTP酶效应物、肌动蛋白细胞骨架重组以及与内吞作用、吞噬体和溶酶体相关的信号通路有关；Group C（r7, r8），富集胆固醇生物合成、脂质稳态、胆汁分泌、补体和凝血级联反应、RNA剪接以及内质网应激应答通路。

  参与调节形态发生的通路在r3中特征性上调；对r3做亚群细分，可以进一步分为3个亚簇（图2A）。亚簇3.3表达最高水平的上皮基因和最低水平的间充质标志物（图2B）；肝细胞特异性标志物的表达在亚簇3.3中也最高。上皮标志物和肝细胞特异性基因在亚簇3.1中的表达最低，该亚簇富集增殖标志物、间充质细胞标志物和Zeb1（上皮-间充质转化（EMT）的转录调节因子）的细胞。亚簇3.2在UMAP上位于相对间充质的亚簇3.1附近，显示出同时富集上皮和肝细胞特异性特征以及波形蛋白的混合表达模式。因此，作者得出结论，r3可能包含正在经历EMT的增殖性肝细胞。r7是所有肝细胞亚群中最具增殖性的簇，其次是r3和r9（图2C）。相比之下，增殖标志物在r8中几乎不存在，该簇表达胆管型祖细胞（Tnfrsf12a, Sox9）、肝细胞祖细胞（Axin2, Afp）和多能肝干细胞样细胞（Yap, Igfbp3）标志物（图2D）；此外，r8显著富集先前在慢性损伤中鉴定的肝细胞衍生导管型祖细胞特征，进一步支持了r8的胚胎样特征（图2E）。鉴于层级聚类的相似性，r7和r8可能分别代表了活跃循环肝细胞和相对非增殖的肝上皮祖细胞。总之，从转录组分析中获得的结果表明，在肝脏再生过程中，肝细胞分化为经历增殖重编程的部分和维持肝脏基本代谢责任的部分。

图2 单细胞分辨率细胞亚型分布

  3. 轨迹分析表明再生肝脏中肝细胞的功能异质性源于基因的重编程

  为了探索再生肝脏中肝细胞表型转换动态，进行了RNA速率分析（RNA velocity）。该分析利用剪接与未剪接RNA分子的比率来预测细胞的未来状态，速率转换由向量大小和箭头方向反映。轨迹分析显示，r1和r4中细胞表达高水平的代谢相关基因，相对缺乏向量（图2F）；r2, r5, r6和r7表现出许多长而强的向量，似乎主要经历向另一个独特状态r8的快速过渡。r8的祖细胞性质（图2D和E）和r3的混合上皮/间充质特征（图2B）表明，这些速率路径代表了实时重编程事件，其中成熟的肝细胞在再生过程中去分化为更原始的状态。值得注意的是，r2和r5似乎是两个最有可能促成r8发展的簇（图2F）。

  4. snATAC-seq揭示肝细胞在肝脏再生过程中染色质景观的异质性

  在再生过程中表观遗传变异发生的程度，以及是否所有肝细胞都重塑其染色质景观以进入和退出增殖状态，仍不清楚。后者将表明细胞命运和肝脏特异性功能的非常动态的全局变化通常在再生过程中得以保留。因此，为了探索肝脏再生过程中染色质调控景观的时间变化，通过分析在PHx前和PHx后48、72和96小时收获的肝细胞核，生成了一系列时间依赖的bulk ATAC-seq数据（图1A）。通过将PHx后的每个时间点与未受损的肝脏（0小时）进行比较，鉴定了551个在至少一个时间点显著差异可及（DA）的顺式调控序列（图3A）。对这551个区域的无监督聚类识别出6个独特的模块，这些模块在定义的时间间隔内具有不同的动力学特征（图3B）。例如，模块III、IV和VI在PHx后48小时显示出最大程度的染色质可及性降低，富集了与代谢过程相关的生物通路（图3C），与肝脏暂时限制其典型代谢功能以满足大规模再生需求的报告一致。模块I和II在48小时显示出染色质可及性的显著增加，显著富集了与胚胎发育和组织形态发生相关的GO通路（图3C），表明此时肝细胞可能参与了去分化重编程过程。然而，bulk ATAC-seq分析仅提供了由最丰富细胞群体信号主导的平均染色质谱，因此缺乏解析细胞异质性和亚型特异性的敏感性。因此，尚不清楚是所有肝细胞还是仅一部分肝细胞启动了这些与重编程相关的染色质变化。

  为了解决bulk检测的局限性，作者进行了snATAC-seq，最终保留了3658个单细胞ATAC测序数据集，用于下游分析。使用从ArchR包中改编的无偏聚类策略，该策略可以有效地基于其整体基因组相似性揭示不同的细胞群体。首先将属于同一簇的细胞聚类以组装拟bulk信号谱，然后进行peak调用。使用Seurat实聚类算法，生成了未受损肝脏（0小时）中肝细胞的染色质可及性谱，并在UMAP中可视化（图3D）。为了定义此图上的细胞簇，估计了基因评分矩阵，该矩阵考虑了基因及其附近顺式调控元件的染色质可及性。基因注释揭示了两个不同的群体：一个主要由肝细胞组成的主群体和一个由非实质细胞类型（包括Kupffer细胞和内皮细胞）组成的次群体。肝细胞是异质的，并显示出与先前定义的功能标志物匹配的梯度表达模式（图3E），表明从未受损肝脏中获得的snATAC-seq数据忠实地再现了健康肝脏的典型转录特征，并且每个亚类的肝细胞具有独特的染色质可及性景观。

图3 肝再生过程中的snATAC分析

  在整合了未受损肝脏中肝细胞的染色质可及性框架后，为了揭示再生肝脏中肝细胞在PHx后48小时与未受损肝脏（0小时）的共享和独特分子特征，作者合并了数据集并分析了来自两个时间点的细胞（总共6858个细胞）。UMAP聚类识别出7个具有DA染色质特征的细胞簇（图4A）。在这些簇中，BC_2和BC_3非常独特，它们几乎完全是PHx后48小时特异（BC_2中98.6%；BC_3中97.9%）（图4B）。因此，将这两个簇定义为“再生特异性”肝细胞，其他簇定义为“未受损肝脏样”肝细胞。然后，根据其分配的身份（再生特异性与未受损肝脏样）对PHx后48小时肝脏中的细胞进行分组，并与未受损肝脏中的肝细胞进行比较分析，以进一步解析表观遗传多样性。相比之下，再生特异性肝细胞和未受损肝脏中的肝细胞之间鉴定了1813个DA染色质区域（398个可及性增加；1415个可及性减少）（图4C）。这些DA区域的峰值注释显示，胚胎发育、细胞骨架组织和细胞形状调节在再生特异性细胞中显著富集，而代谢和生物合成过程则减少（图4D）。与先前bulk分析结果一致，这些结果表明，再生肝细胞亚群重塑了其染色质结构并经历了成熟到胚性的重编程。

图4 snATAC-seq分析显示了再生肝中肝细胞的异质性

  5. snATAC-seq和scRNA-seq整合分析揭示胚性肝细胞群体的独特染色质景观

  作者整合了独立获得的PHx后48小时肝细胞snATAC-seq和scRNA-seq数据集，以在单细胞分辨率下共同重建肝再生路径（图5A）。在将r8的转录组与其染色质景观联系起来后，接下来旨在揭示上游的调控因子并将特定TFs与选定的细胞结果相关联。使用chromVAR对PHx后48小时的snATAC-seq数据进行评估，量化检测共享相同motif的peak内的差异，识别了几个家族的TFs，这些TFs可能是r8胚性状态的原因（图5B）。在这些TFs中，Smad 2, Snail和Hedgehog通路靶标Gli2是EMT的转录调节因子，EMT是胚胎发生过程中细胞状态转换的关键机制。Gata6, Sox9和Sox17的富集进一步支持了再生簇r8的干细胞/祖细胞样特征。值得注意的是，Sox17标记了内胚层祖细胞，这些祖细胞根据Hedgehog信号分化为胰腺或肝上皮细胞，并且除了Gli2的富集外，还明显激活了参与胰腺发育的TFs，包括Mafa, Pbx1和Neurod1。

  接下来进行了IHC，以确定上述6种胚性肝细胞相关TFs中的任何一种，是否在PHx后48小时的肝细胞核中积累（图5C）。作为阳性对照，作者对Yap1进行了染色，因为Yap1是一种干细胞/祖细胞相关转录共激活因子，当持续激活时，它会诱导成熟肝细胞分化为干细胞样状态。与未受损肝脏相比，再生肝脏中每种胚性状态相关蛋白的肝细胞核积累增加，在未受损肝脏中，观察到可忽略的肝细胞核染色。PHx后，胚性TF积累是异质的，阳性染色的肝细胞往往在门静脉周围（即区1）最丰富。门静脉束中的孤立胆管细胞也表达了一些这些标志物。对scRNA-seq数据的更系统分析证实，Sox9的表达（胆管细胞和来自去分化的小门静脉肝细胞标志物）在r8中最高，并且在r2和r5中可检测到，这些簇产生r8（图2F）。Sox9由Gli2诱导，Gli2还反式激活Atoh1，Atoh1是初级纤毛生成所需的TF，初级纤毛是经典Hedgehog信号传导的必需结构。初级纤毛在成熟肝细胞中不存在，但在表达胆管标志物的肝祖细胞中存在。与Sox9和Gli2类似，Atoh1染色质可及性在r8中特异增加（图5B）。总之，这些发现表明，PHx后48小时，再生簇r8包括双能祖细胞，这些祖细胞已知在成年肝脏中在其他急性或慢性损伤后出现；更重要的是，识别了状态变化的表观遗传调节因子，这些状态变化导致了它们的生长。总之，这些数据表明，在成年肝脏再生过程中，一部分肝细胞重新激活了类似于胚性发育的过程。

图5 整合组学分析确定转录因子活性的特定细胞亚型

  6. snATAC分析揭示了PHx后胚性肝细胞的短暂性事件

  为了确定胚性肝细胞在急性再生挑战后持续多长时间，在PHx后72和96小时对新鲜分离的肝细胞核进行了snATAC-seq。对48、72和96小时总共10,756个细胞核的整合分析，鉴定到7个细胞簇，命名为APc_1-7（图6A）。来自不同时间点的细胞整合良好，未检测到批次效应，尽管每个簇的相对贡献是时间点依赖的（图6B）。整合数据的拟时序分析重建了从48小时的胚性状态开始并在96小时返回成熟肝细胞的发育轨迹（图6C）。

  接下来进行了IHC，以确认胚性肝细胞ATAC“特征”的消失与在这些较晚时间点获得的肝脏切片中7种代表性胚性TFs的丢失相关（图6D）。72和96小时中每种TFs的染色弱于48小时，96小时接近未受损肝脏中几乎不可检测的水平。总之，以上分析表明，肝脏损伤启动了一些成熟肝细胞的染色质景观变化，这些变化使它们能够过渡到胚性状态，与增殖峰型吻合，并在肝脏质量恢复后消失。

图6 拟时序分析显示了PHx后胚性细胞状态的短暂性

    研究意义与展望  

  理论价值：

  揭示肝细胞通过表观遗传重编程实现“代谢-再生”双功能平衡的机制；

  提出“成熟肝细胞可逆胚性化”模型，解释肝脏快速再生的细胞基础。

  应用前景：

  再生医学：靶向调控Sox9、Yap1等因子或可增强肝损伤后的修复能力；

  疾病治疗：抑制胚性肝细胞的异常激活可能预防肝硬化或肝癌进展。

  未来方向：

  结合空间转录组技术，定位肝小叶内不同区域细胞的再生特征；

  开发单细胞扰动测序（Perturb-seq），验证关键调控因子的因果关系。

  说在最后  

  本研究通过单细胞ATAC多组学技术，首次全景式解析了肝脏再生中肝细胞的异质性分化与表观遗传动态，不仅深化了对器官再生机制的理解，也为肝衰竭、肝癌等疾病的干预策略提供了新的分子靶点。未来，结合机器学习与跨物种分析，将进一步推动精准再生医学的发展。

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  参考文献：

  Chen T, et al. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 2020;5(22):e141024 .
DOI: 10.1172/jci.insight.141024