大家好！今天我们要聊的是一篇关于阿尔茨海默病（AD）的重磅研究，题目是《Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer’s disease》，作者联合单细胞RNA测序（snRNA-seq）和单细胞ATAC测序（snATAC-seq）系统解析了AD患者大脑组织中复杂的基因调控网络。听起来是不是有点头大？别担心，我们会用最轻松的方式来解读这篇“脑洞大开”的论文！

  想象一下，你的大脑里有无数个细胞在忙碌工作，有的负责思考，有的负责记忆，还有的负责清理“垃圾”。然而，当阿尔茨海默病来袭时，这些细胞的工作节奏被打乱，甚至有些细胞开始“罢工”。这篇研究就是通过snRNA-seq和snATAC-seq，深入探讨了这些细胞在AD中的“工作状态”和“沟通方式”。

  简单来说，研究人员发现，AD患者的大脑细胞不仅在基因表达上发生了变化，染色质的可及性也发生了显著改变。这些变化导致了细胞功能的紊乱，尤其是胶质细胞（如小胶质细胞和星形胶质细胞）在AD中扮演了重要角色。通过这项研究，科学家们不仅揭示了AD的潜在机制，还为未来的治疗提供了新的思路。

  准备好了吗？让我们一起揭开阿尔茨海默病背后的细胞秘密吧！

  主要研究内容  

  1. snRNA-seq联合snATAC-seq绘制人类前额叶皮层的单细胞多组学图谱

  作者首先对来自晚期阿尔茨海默病（AD）患者和年龄匹配的认知健康对照者的前额叶皮层（PFC）进行了snATAC-seq和snRNA-seq（图1a）。随后作者对批次校正后的表观基因组和转录组数据集应用了均匀流形近似和投影（UMAP）降维和Leiden聚类，识别出snATAC-seq和snRNA-seq（图1b-c）中的不同细胞类型簇。通过snATAC-seq，作者分析了大脑的所有主要细胞类型--兴奋性神经元（24076个核；EX.a-e）、抑制性神经元（9644个核；INH.a-d）、星形胶质细胞（15399个核；ASC.a-f）、小胶质细胞（12232个核；MG.a-e）、少突胶质细胞（62253个核；ODC.a-m）和少突胶质细胞前体细胞（4869个核；OPC.a），基于已知标记基因启动子区域的染色质可及性进行注释（图1d）。同样，作者使用snRNA-seq检测到类似的细胞类型，兴奋性神经元（6369个核；EX1-5）、抑制性神经元（5962个核；INH1-4）、星形胶质细胞（4756个核；ASC1-4）、小胶质细胞（4126个核；MG1-3）、少突胶质细胞（37052个核；ODC1-13）和少突胶质细胞前体细胞（2740个核；OPC1-2），通过细胞类型标记基因的表达进行分类（图1e）。

由于表观基因组景观与下游基因表达特征密切相关，作者使用Seurat的整合平台整合了snATAC-seq和snRNA-seq数据集（图1f）。使用染色质数据或转录组数据独立分类的细胞类型在整合的UMAP空间中绝大多数聚集在一起（图1g）。在snATAC-seq和snRNA-seq中使用相同的生物样本导致这两种数据模式的细胞核在联合构建的空间中高度重叠。

图1：snATAC-seq和snRNA-seq用于研究患病大脑中的细胞多样性

  2. AD患者大脑组织中细胞异质性的多组学表征

  在snATAC-seq和snRNA-seq中，作者发现了多个神经元和胶质细胞亚群，并根据先前鉴定的标记基因对snRNA-seq中的亚群进行了注释（图2）。对于作者的snATAC-seq簇，作者使用Seurat的标签转移算法计算簇预测分数，从而对作者的细胞簇进行监督注释。作者检查了每个簇在疾病背景下的组成，发现在两种数据模式中，有几个簇在晚期AD中显著过度或不足（图2d-g）。ASC3在疾病中的比例显著增加，而ASC4显著减少，这与最近对SXFAD小鼠模型的snRNA-seq研究一致。此外，作者识别了每个细胞簇在晚期AD中的差异可及染色质区域和DEGs，并发现远端和近端差异可及染色质区域以及DEGs的基因本体（GO）术语富集具有高度簇特异性。总之，作者发现了晚期AD中的簇特异性表观遗传和转录组变化，这可能解释了不同细胞亚群在神经退行性疾病中不同生物途径的失调。

图2：人类AD前额叶皮层中表观遗传学和转录上不同的细胞亚群

  3. 晚期AD患者中的细胞类型特异性顺式基因调控

  基于作者在相同样本中使用snATAC-seq和snRNA-seq的实验设计，作者推断可以识别特定细胞群体中cCREs的靶基因。为此，作者试图通过构建顺式共可及性网络（CCANs）来阐明晚期AD中PFC的顺式调控架构，分别针对晚期AD和对照样本中的每种细胞类型）。为了识别cCREs的靶基因，作者专注于其中一个峰位于启动子元件中的共可及峰子集，产生一组cCREs和候选靶基因。对于这组共可及链接，作者将候选靶基因的表达与cCRE的染色质可及性相关联，加强了超越共可及性的潜在调控关系的证据。最后，作者使用NMF分析和聚类这些基因链接的cCREs，基于它们在每种细胞类型中的染色质可及性。作者通过非负矩阵分解（NMF）对这些基因关联的cCREs进行分析和聚类，基于它们在每种细胞类型中的染色质可及性。作者识别了56552个gl-cCREs，这些cCREs与至少一个基因相关联（图3a）。大多数基因平均与4个cCREs相关联，而少数基因与超过25个cCREs相关联（图3a）。为了进一步理解这些cCREs的功能，作者检查了它们在基因组中的分布，发现58.35%的gl-cCREs位于内含子区域，29.92%位于远端区域，11.73%位于外显子区域（图3e）。作者还发现，不同细胞类型之间的cCREs关联基因集存在显著重叠（图3b），表明某些基因可能受到多种细胞类型的调控。

  为了进一步验证这些cCREs的功能，作者检查了它们与差异表达基因（DEGs）的重叠情况。作者发现，cCREs关联的基因集与细胞类型特异性DEGs以及AD诊断相关的DEGs存在显著重叠（图3c）。例如，在星形胶质细胞中，cCREs关联的基因集与AD上调的基因集显著重叠，而在少突胶质细胞中，cCREs关联的基因集与细胞类型特异性DEGs显著重叠。这些结果表明，cCREs在调控细胞类型特异性和疾病相关的基因表达中发挥了重要作用。

图3：将特定细胞类型中的下游靶基因连接起来

  4. 晚期AD患者脑组织中关键转录因子的调控作用

  为了进一步理解转录因子（TFs）在AD中的调控作用，作者使用chromVAR分析了snATAC-seq数据中的TF基序变异性。作者识别了在AD中显著富集的TF基序，并发现这些基序在不同细胞类型中的富集模式不同。例如，SPI1在小胶质细胞中的基序变异性显著增加（图4a），而NRF1在少突胶质细胞中的基序变异性显著增加（图4d）。这些结果表明，SPI1和NRF1可能在AD中分别调控小胶质细胞和少突胶质细胞的功能。

  作者还构建了细胞类型特异性的TF调控网络。对于每个TF，作者识别了其候选靶基因，这些基因的启动子或关联的cCREs在特定细胞类型中可及并包含该TF的结合基序。作者生成了小胶质细胞和少突胶质细胞特异性的TF调控网络（图4g-h）。在这些网络中，作者识别了多个AD相关的DEGs，以及位于已知AD GWAS位点的基因，这些基因受到SPI1和NRF1的调控。

图4：AD晚期细胞亚群特异性转录因子的调控

  5. 胶质细胞的多组学轨迹分析

  为了进一步揭示AD中胶质细胞异质性的分子机制，作者使用Monocle3对整合的snATAC-seq和snRNA-seq数据进行了伪时间轨迹分析。多组学轨迹分析使作者能够研究基因表达和染色质可及性在胶质细胞中的动态变化。作者构建了少突胶质细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞的整合轨迹（图5a,6a,6g）。

  在少突胶质细胞中，作者构建了一个包含58221个snATAC-seq核和36773个snRNA-seq核的整合轨迹（图5a）。作者发现，随着轨迹的推进，晚期AD样本的核比例显著增加（图5b；Pearson相关系数R=0.32，P值=0.022）。为了阐明少突胶质细胞在晚期AD中的功能状态，作者检查了新形成的少突胶质细胞（NF-ODCs）、髓鞘形成少突胶质细胞（MF-ODCs）和成熟少突胶质细胞（mature ODCs）的基因表达特征（图5c）。作者发现，成熟少突胶质细胞的基因表达特征在轨迹的末端增加，而髓鞘形成少突胶质细胞的基因表达特征减少。此外，新形成的少突胶质细胞的基因表达特征在整个轨迹中减少，表明少突胶质细胞的伪时间轨迹再现了少突胶质细胞的成熟过程。

图5：多组学少突胶质细胞的运动轨迹分析

  在小胶质细胞中，作者构建了一个包含10768个snATAC-seq核和4119个snRNA-seq核的整合轨迹（图6a）。作者发现，随着轨迹的推进，晚期AD样本的核比例显著增加（图6b；Pearson相关系数R=0.53，P值=6.9 × 10^-5）。作者研究了疾病相关小胶质细胞（DAM）的基因表达特征，这些特征在5XFAD小鼠的单细胞转录组研究中被引入，并在AD基因组学领域引起了广泛讨论。DAM被描述为AD相关的吞噬性小胶质细胞，它们在TREM2依赖和非依赖的阶段（阶段1和阶段2）依次激活。作者发现，整合的小胶质细胞轨迹遵循稳态特征的减少、阶段1 DAM特征的增加以及阶段2 TREM2依赖的DAM特征的显著减少（图6c）。

  在星形胶质细胞中，作者构建了一个包含12112个snATAC-seq核和4704个snRNA-seq核的整合轨迹（图6g）。作者发现，随着轨迹的推进，晚期AD样本的核比例显著增加（图6h；Pearson相关系数R=0.57，P值=1.9 × 10-3）。作者研究了疾病相关星形胶质细胞（DAAs）的基因表达特征，这些特征在5XFAD小鼠海马的snRNA-seq研究中被描述为AD特异性的GFAPhigh星形胶质细胞亚群，与在老年野生型和5XFAD小鼠中发现的另一个GFAPhigh星形胶质细胞亚群不同。基于DAA基因特征分析，作者推断该轨迹遵循从GFAP-low状态到GFAP-high和DAA样状态的趋势（图6i）。

图6：多组学小胶质细胞和星形胶质细胞的轨迹分析

  6. AD相关遗传风险位点的细胞类型特异性调控机制

  为了进一步理解AD遗传风险信号，作者在snATAC-seq簇中使用连锁不平衡评分回归（LDSC）分析了AD和其他相关性状的GWAS汇总统计。小胶质细胞簇MG.b和MG.c显示出对Kunkle等人研究的AD GWAS SNPs的显著富集（FDR<0.05），所有五个小胶质细胞簇显示出对Jansen等人研究的GWAS SNPs的显著富集，该研究包括家族性AD代理样本以及AD患者的数据（图7a）。这一GWAS遗传力分析的结果支持了之前在非疾病人类和小鼠snATAC-seq数据中的发现。作者进一步使用gchromVAR分析了小胶质细胞伪时间轨迹中精细定位的AD相关多态性的富集，并观察到在整个小胶质细胞轨迹中，远端峰的gchromVAR偏差评分显著增加（Pearson相关系数，P值=0.0048；图7b-c），与基因近端峰分析的偏差评分显著减少形成鲜明对比（Pearson相关系数，P值=0.0053），突出了DAM中远端增强子的AD相关SNPs。通过将共可及性图谱与染色质可及性信号和GWAS统计沿基因组轴叠加，作者揭示了GWAS基因中因果疾病变异破坏的潜在顺式调控关系（图7d-i）。作者发现，APOE位点（包含AD遗传力的主要决定因素，并且是研究最深入的AD风险位点之一）在小胶质细胞和星形胶质细胞中的顺式调控染色质网络在疾病中发生了改变，突出了进一步研究使用基因组编辑技术的cCREs。

图7：AD大脑中GWAS位点的细胞类型特异性调控景观

  7. 使用scWGCNA进行单细胞共表达网络分析

  在系统级框架snRNA-seq数据，作者试图开发一种基因共表达网络分析方法基于加权基因共表达分析（WGCNA），一个强大的分析方法识别疾病相关基因模块最初设计的体积基因表达数据。作者特别强调了作者对少突胶质细胞的scWGCNA分析；作者发现了四个与AD诊断显著相关的共表达模块——OM1、OM2、OM4和OM5（图8a、b）。作者发现其中三个少突胶质细胞模块显著富集了SREBF1的靶点，这表明SREBF1在调节这些模块的基因表达中的重要性（图8c）利用来自bulk RNA-seq、高通量蛋白质组学和SREBF1染色质免疫沉淀（ChIP）的多尺度测序数据，作者定义了SREBF1靶基因的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络。此外，作者发现在早期和晚期AD样本中，SREBF1模块特征基因表达在蛋白和RNA水平下调（图8d），snATAC-seq数据中SREBF1基序变异下调得到证实。作者还通过RNA原位杂交和免疫组化验证了SREBF1在晚期AD中的下调，发现晚期AD中SREIF-seq数据中ACSL4的靶点之一（图8e-g）。总的来说，作者的共表达网络分析方法有助于识别细胞类型特异性疾病生物学，作者强调了少突胶质细胞中的TF SREBF1，主要是尚未在AD的背景下进行研究，以证明作者的方法能够产生新的疾病见解。

图8：使用集成数据和scWGCNA揭示了复杂的基因表达模块

  结论  

  本项研究的作者通过整合snATAC-seq和snRNA-seq数据，深入揭示了晚期AD患者中细胞异质性和基因调控网络的复杂性。以下概况一下本研究的主要发现：细胞类型特异性顺式调控元件（cCREs）的识别，转录因子（TFs）的调控作用，胶质细胞的动态变化，AD遗传风险位点的细胞类型特异性调控（scWGCNA）。

  这项研究不仅提供了AD中细胞类型特异性基因调控的全面视角，还为未来的治疗策略提供了新的潜在靶点。通过整合多组学数据，作者揭示了AD病理过程中复杂的细胞和分子机制，为理解这一复杂的神经退行性疾病提供了重要见解。未来的研究可以进一步探索这些调控机制，并开发针对特定细胞类型和基因模块的治疗方法。

  说在最后 

  好了，今天的“脑细胞大冒险”就到这里啦！通过这篇多组学研究，作者不仅看到了AD患者大脑细胞的“混乱状态”，还了解到胶质细胞在疾病中的关键作用。不得不说，大脑真是个复杂的“办公室”，每个细胞都有自己的职责，而当AD这个“捣蛋鬼”出现时，整个系统都会陷入混乱。

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项目经验展示

  参考文献：

  Morabito S, Miyoshi E, Michael N, Shahin S, Martini AC, Head E, Silva J, Leavy K, Perez-Rosendahl M, Swarup V. Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer's disease. Nat Genet. 2021 Aug;53(8):1143-1155. doi: 10.1038/s41588-021-00894-z. Epub 2021 Jul 8. PMID: 34239132; PMCID: PMC8766217.