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    生物前沿洞察-《Developmental Cell》｜类器官联合单细胞 ATAC-seq 揭秘小鼠肠道上皮细胞命运调控新机制

    2025-06-20 17:57:21

    阅读(196)

      肠道上皮的特征是具有高度的细胞更新率，这种快速更新主要依赖位于隐窝底部的 Lgr5+肠道干细胞 (ISCs) 的分裂。这些 ISCs 既可以自我更新，也可以分化成祖细胞 (PCs)。后者进一步沿隐窝-绒毛轴产生分泌谱系（杯状细胞、潘氏细胞、簇状细胞和肠内分泌细胞）和吸收谱系（肠上皮细胞）。这一过程受到精细但尚未充分理解的肠道上皮可塑性机制的调控。尽管 Lgr5+ ISCs 在维持肠上皮细胞方面起着关键作用，但肠上皮细胞的维持并不完全依赖于这些细胞。

      Wnt信号通路是维持IECs稳态的主要信号通路。Wnt信号的启动涉及Wnt配体与Frizzled（Fzd）受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（Lrp5/6）的结合。在Wnt信号通路中，Fzd受体家族扮演着关键角色，尽管已有研究表明某些Fzd受体如Fzd7与ISCs的自我更新或分化有关，Fzd5与潘氏细胞成熟相关，特别是Fzd受体家族的不同成员在ISCs功能和肠道修复中的作用提示了靶向Fzd5等受体的潜在治疗价值。

      2024年11月发表在Developmental Cell的一篇研究论文《Frizzled5 controls murine intestinal epithelial cell plasticity through organization of chromatin accessibility》，研究人员通过scRNA-seq和scATAC-seq的联合分析，结合CUT&Tag等实验发现Fzd5主要在ISCs和PCs中调控染色质可及性，影响干细胞和谱系相关基因的表达。

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      研究思路分析  

      1.提出问题

      肠道上皮细胞的动态平衡是如何维持的？肠道干细胞的命运是如何决定的？

    Wnt 信号通路在肠道稳态中扮演什么角色？Fzd5 在肠道上皮细胞中有什么功能？它是否参与调控肠道干细胞的命运？

      2.寻找线索

      文献调研发现Fzd5与其他Wnt信号通路成员相互作用，提示 Fzd5可能通过Wnt信号通路调控肠道稳态。通过scRNA-seq分析发现Fzd5表达覆盖肠道上皮多种细胞类型，包括 Lgr5+干细胞、TA细胞（过渡扩增细胞）、祖细胞及部分分化细胞（如肠上皮细胞早期），且在过渡态细胞（兼具干细胞与分化特征）中表达量较高（图1A），提示Fzd5可能参与多细胞类型的协同调控，而非局限于某一特定细胞群。RNA原位杂交显示，Fzd5 mRNA 主要分布于隐窝上部区域，与 Lgr5+干细胞的隐窝底部富集模式形成对比，而与Krt19+细胞（储备干细胞 / 祖细胞）的分布重叠（图1B）。隐窝底部以干细胞自我更新为主，上部则是祖细胞向分化命运抉择的关键区域，Fzd5的定位暗示其可能调控细胞从增殖向分化的切换。与Krt19 +细胞共定位，提示Fzd5可能在储备干细胞或祖细胞的谱系分化中起关键作用，而非直接作用于Lgr5+干细胞本身。

      结合scRNA-seq和RNA原位杂交的结果可以得到在时间纬度上在干细胞分裂产生祖细胞后，Fzd5随细胞迁移至隐窝上部时表达上调，驱动祖细胞进入分化程序。空间维度：隐窝底部低水平Fzd5参与维持Lgr5+干细胞的自我更新（需结合后续敲除实验验证）。隐窝上部高水平Fzd5可能调控Krt19+祖细胞的染色质可及性，促进分泌型谱系分化（如杯状细胞、肠内分泌细胞）。

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      3.验证猜想

      接下来研究人员关于Fzd5基因在Lgr5+肠道干细胞中的功能研究实验。通过基因敲除技术（Fzd5KO）来探究Fzd5在体内对Lgr5+ ISCs的影响。实验结果表明，Fzd5的缺失会导致Lgr5+隐窝数目的显著减少，尤其是在短期效果尤为明显。然而，这种减少在两周内逐渐恢复，表明Fzd5虽然在短期内对ISC的功能有重要影响，但其并不是完全不可替代的，因为其他细胞类型可能参与了再生过程。进一步的scRNA-seq数据分析揭示了Lgr5+ISCs群体内的异质性，特别是Lgr5lo_Mki67int细胞的独特特性，它不仅是不同细胞类型的潜在关键节点，还表达了多种特定的生物标记物。最后，长期观察显示，Fzd5对Lgr5+ISCs的长期再生和稳定状态的维持都具有重要作用。

      先前的研究表明，主要位于Lgr5+ISCs之上的Krt19+细胞，可以追踪肠道内所有上皮细胞谱系。利用Krt19-Cre-ERT2;mTmG品系来同时标记和追踪Krt19+GFP细胞。与在Lgr5-Fzd5KO小鼠中的观察结果一致，Krt19+细胞中Fzd5的缺失并未导致明显的隐窝恶化或影响整体隐窝细胞增殖（图2G），并且潘氏细胞群未受到影响。然而，Fzd5缺失后，Krt19+细胞对所有IECs的贡献能力受到了严重损害。Fzd5的缺失导致典型的克隆“带状”模式出现显著破坏，取而代之的是绒毛区域的零星标记（图2H、2I）。考虑到这些结果，认为Fzd5调节单个隐窝上皮细胞的能力，从而影响其对更新或分化过程的倾向性。

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      4.深入机制

      对Ctrl和Fzd5KO小鼠的肠道上皮细胞进行CUT&Tag实验，Fzd5 敲除导致肠道上皮细胞染色质可及性降低，抑制了部分基因的转录。通过scATAC-seq进一步分析Fzd5敲除后不同细胞类型染色质可及性的变化，Fzd5敲除对不同细胞类型的染色质可及性影响不同，导致干细胞相关基因表达下调，肠细胞相关基因表达上调，促进细胞分化向肠细胞方向转变。对scATAC-seq数据进行motif分析，识别在Ctrl组和Fzd5KO组中差异富集的转录因子结合位点，Fzd5敲除通过影响转录因子 (TCF/LEF和AP-1) 的活性，进而调控下游基因的表达，影响肠道干细胞的命运。



      5.验证结果

      从Villin-Cre-ERT2Fzd5flox/flox小鼠空肠分离的隐窝中生成了类器官。 在用4-OHT诱导Cre介导的重组后，观察到类器官增殖显著下降，以及Fzd5和干细胞相关基因表达的显著降低。这个体外模型证实了体内研究结果，展示了分化向肠细胞的转变。为了评估Fzd7潜在的协同作用，进一步应用了基于shRNA来敲低Fzd7，Fzd7的敲低加剧了由Fzd5缺失引起的类器官增殖减少。

      为了评估影响Fzd5功能的外在信号，通过分析已发表的scRNA-seq数据检测了肠间质细胞中各种Wnt配体和Fzd受体的表达情况，几乎没有观察到Fzd5在干细胞微环境细胞中的表达，暗示其作用可能依赖于旁分泌而非自分泌信号。先前的研究已经探讨了不同Wnt配体对肠类器官的影响。实验还揭示了两种重要的Wnt配体Wnt3A和Wnt5A的不同作用：Wnt3A可以通过补偿机制恢复Fzd5缺陷类器官的生长能力，而Wnt5A则在无Fzd5的情况下促进特定类型的肠上皮细胞分化。Wnt信号通路对肠道细胞命运的调控是复杂的，并且高度依赖于Fzd5的存在状态。

      6.研究结论

      总而言之，Fzd5作为Wnt信号通路的重要成员，在调控肠道上皮细胞可塑性中发挥着关键作用，参与调控肠道干细胞的命运，维持肠道稳态。

      研究人员也指出了当前研究的局限性，即潜在的分子机制尚未完全阐明。虽然研究发现了Fzd5敲除后候选转录因子基序的可及性发生了变化，但是这些转录因子，特别是像 AP-1 这样的复合物的结合能力，还需要进一步的实验验证。这暗示了Fzd5可能通过影响某些转录因子的活性或结合，进而调控肠道上皮细胞的功能。

      此外，该研究主要集中在小鼠肠道，未来的研究应该考察小鼠和人类肠道系统之间的相似性和潜在差异。因为不同物种之间存在生理和遗传差异，在小鼠中观察到的现象可能不完全适用于人类。

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    参考文献：

    Deng L, He XC, Chen S, Zhang N, Deng F, Scott A, He Y, Tsuchiya D, Smith SE, Epp M, Malloy S, Liu F, Hembree M, Mu Q, Haug JS, Malagola E, Hassan H, Petentler K, Egidy R, Maddera L, Russell J, Wang Y, Li H, Zhao C, Perera A, Wang TC, Kuo CJ, Li L. Frizzled5 controls murine intestinal epithelial cell plasticity through organization of chromatin accessibility. Dev Cell. 2025 Feb 3;60(3):352-363.e6. doi: 10.1016/j.devcel.2024.10.021. Epub 2024 Nov 22. PMID: 39579769; PMCID: PMC11794035.


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    来源：寻因生物SeeKGene公众号

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