█ 前言 .

  大家好！今天作者要聊的是一篇关于动脉粥样硬化的重磅研究，题目是《Endothelial Reprogramming by Disturbed Flow Revealed by Single-Cell RNA and Chromatin Accessibility Study》。听起来是不是有点复杂？别担心，小编会用最轻松的方式来解读这篇“血管细胞大揭秘”的论文！

  想象一下，你的血管里有无数个内皮细胞在忙碌工作，有的负责维持血管的稳定性，有的负责调节血流速度，还有的负责控制血管炎症。然而，当血流紊乱（disturbed flow，d-flow）来袭时，这些细胞和谐的工作节奏被打乱，甚至有些细胞开始“变坏”。本次小编要分享的文章就是通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞ATAC测序（scATAC-seq），深入探讨了这些细胞在血流紊乱中的“工作状态”和“沟通方式”。

  简单来说，研究人员发现，血流紊乱不仅改变了内皮细胞的基因表达，还影响了染色质的可及性，导致内皮细胞从抗炎、抗动脉粥样硬化的表型转变为促炎、促动脉粥样硬化的表型。通过这项研究，科学家们不仅揭示了血流紊乱如何通过表观遗传和转录调控影响内皮细胞，还为未来的治疗提供了新的思路。

  准备好了吗？大家和小编一起揭开血流紊乱背后的细胞秘密吧！

  主要研究内容  

  1. 单细胞RNA测序和ATAC测序揭示内皮细胞的异质性

  作者首先通过小鼠部分颈动脉结扎（PCL）模型，分别对稳定血流（s-flow，对照组）和扰动血流（d-flow，实验组）条件下的颈动脉内皮细胞（ECs）进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）和染色质可及性测序（scATAC-seq）。通过marker基因注释(图1C、G)，scRNA-seq鉴定出16个(图1A)细胞簇（8个EC亚群、T细胞、DC细胞、SMCs、成纤维细胞及4个巨噬细胞亚群），scATAC-seq检测到13个(图1E)细胞簇，与转录组结果高度一致（Pearson r=0.89）。s-flow条件下以E2亚群（高表达KLF2/4）为主，急性d-flow（2天）诱导E5/E7亚群出现，慢性d-flow（2周）导致E8亚群（促炎表型）占主导（p<0.001）(图1B、F)。慢性d-flow（2周）显著增加巨噬细胞（28.4%）、平滑肌细胞（18.2%）浸润（图1D，H）。由此发现血流紊乱直接改变血管壁细胞组成，为动脉粥样硬化病灶形成提供微环境。

图1 scRNA-Seq和scATAC-Seq聚类和细胞鉴定

  scATAC-seq用于分析表观基因组染色质可及性，表明了每个细胞中潜在的基因活性，而scRNA-seq数据显示了每个细胞中的转录本丰度，这是基因调控的一个不同但互补的方面。作者进一步使用Harmony整合了scRNA-seq和scATAC-seq数据集，共嵌入的UMAP图显示，在scRNA-seq和scATAC-seq数据集中分析的大多数细胞相互重叠，表明大多数细胞簇中染色质可及性和相应的基因转录本表达的变化以一致的方式发生（图2A）。虽然scRNA-seq识别出4个巨噬细胞簇（图1A)，但scATAC-seq仅识别出1个巨噬细胞簇（图1E)。然而，整合结果显示，两个数据集中的所有巨噬细胞簇几乎完全重叠，这表明在作者的研究中确定的所有巨噬细胞簇都不能明显区分。

  scATAC-seq和scRNA-seq数据的单个UMAP图显示了各自的细胞簇身份（图2B和2C）。这些从两种独立的方法获得的结果表明，作者的两个数据集是高度一致的和交叉验证彼此。这表明d-flow对体内单细胞转录和表观基因组染色质可及性水平的全基因组调控的可重复性和稳健的影响。在建立了scRNAseq和scATAC-seq数据之间的高度一致性后，作者通过分析差异基因转录本表达模式来确定每个细胞簇的特征。为此，作者使用scRNA-seq数据集进行了差异表达特征分析，并将所有的细胞簇进行了相互比较，然后使用每个细胞簇中上调的前10个基因来生成热图（图2D）。在E8和E2相比的两个数据集中发现的过表达基因进行了GO分析，发现暴露于慢性d-flow的ECs表现出许多已知的与促动脉粥样硬化途径相关的生物过程的诱导（图2E）。这些结果表明，d-flow通过调节基因转录本和表观基因组染色质可及性谱，诱导ECs以流式和时间依赖的方式向促动脉粥样硬化表型转变。

图2 整合scRNA-Seq和scATAC-Seq数据进行差异基因和通路分析

  2. 拟时序分析揭示内皮转分化路径

  作者随后通过拟时序分析确定了内皮细胞3个主要的分化类型：(1)EC，(2)免疫细胞（巨噬细胞、DC和T细胞），以及(3)SMC和纤维（图3A)。此外，在每种细胞类型的轨迹路径上还存在许多其他细胞，表明它们对d-flow的过渡去分化状态。为了更好地理解轨迹结果，作者将分析结果分为四种实验条件（图3B）。在s-flow条件下（2D-R和2W-R），大多数细胞分化良好，少数细胞处于转化状态。相比之下，d-flow条件诱导许多ECs进入过渡状态，可能向SMCs和纤维反分化，表明EndMT。令人惊讶的是，作者还发现许多ECs在急性d-flow条件下（2D-L）下向免疫细胞过渡，这在慢性d-flow（2W-L）条件下进一步增加。使用E8簇进行的进一步分析显示，这些暴露于慢性d-flow的ECs向免疫细胞样类型（EndICLT）转变，但没有达到完全分化的免疫细胞状态（图3C）。为了验证ECs向其他细胞类型、EndMT和EndICLT的转变，作者进一步检测了关键标记基因的染色质可及性和基因表达谱。图3D显示了EndMT细胞群中TagIn、Acta2、Cnn1和Snai1的4个标记物，分别代表s-flow（E2）、急性d-flow（E6）和慢性d-flow（E8）的染色质可及性变化。d-flow增加了这些标记基因在启动子区域（黑色箭头）或3' UTR（*在Snai1中）的染色质可及性。与可及性变化相一致的是，E8中d-flow暴露的EC中相应的基因表达水平也升高。这些结果证实了d-flow诱导的EndMT与预期一致。在验证了EndMT后，作者进一步利用巨噬细胞标记物C1qa、C1qb、C5ar1和Tnf，分析了潜在的EndICLT的基因标记物。如图3D所示，与s-flow（E2）和急性d-flow（E6）相比，慢性d-flow增加了E8中这些基因在其启动子区域（箭头）的可及性。如scRNA-seq数据的小提琴图（图3E）所示，E8中相应基因的表达增加，进一步证实了D-Flow诱导内皮-间充质转化（EndMT）和内皮细胞向免疫样细胞转化（EndICLT）这一结果。

图3 通过拟时序和可及性分析D-Flow诱导内皮-间充质转化（EndMT）

  如图4所示，作者发现与LS相比，慢性OS降低了KLF2和KLF4的表达，同时诱导了EndMT标志物（SNAI1和TAGLN）的表达。重要的是，慢性OS还诱导了两个巨噬细胞标志基因（C1QC和C5AR1）的表达，直接证明了OS可以在体外诱导EndICLT。此外，作者使用小鼠PCL模型进行了共免疫染色研究，以确定巨噬细胞标志蛋白是否在体内CDH5+内皮细胞中表达。如图4A-4D所示，C1QA和LYZ在LCA内皮细胞中明显上调，而在RCAs中未见上调，为流动诱导的EndICLT提供了更有力的证据。

图4 D-Flow诱导ECs体内和体外培养的免疫细胞标记物的表达

  接下来，作者分析了GO结果（图2E)中确定的d-flow条件下激活的促动脉粥样硬化途径。如图5所示，与E2中的s-flow相比，E8中的d-flow改变了白细胞流量和炎症的标志物（Il1b、Il6、Ccl2和Ccl3）；ECM调节（Adamts4、Lamb1、Timp3和Timp4）；血管调节（Nos3、Ptgs2和Edn1）；脂质代谢（Tm6sf2、Lsr和Mgll）（图5A-5D）。这些结果表明，d-flow激活了致动脉粥样硬化的内皮反应，而通过改变转录和染色质可及性水平上的基因表达来抑制致抗致动脉粥样硬化的通路。

图5.慢性d-Flow重新调节内皮细胞功能

  3. 体内流动依赖的TF结合基序的识别

  紧接着，作者使用Signac和ChromVar软件包对scATAC-seq数据进行分析，来识别对血流扰动敏感的TF结合基序（图6）。在每个内皮细胞簇（E1-E8）中确定了前20个TF结合基序，并将其绘制成一个热图（图6A）。图6B和图6C显示了TF结合基序和发现它们的各自细胞簇。KLF4的TF结合基序在暴露于s-flow的E2中富集，而NRF1在E3和E4中富集（暴露于所有流动条件下）（图6B）。相比之下，TEF、ETV3、RELA、FOS::JUN、TEAD1和STAT1的TF基序在暴露于d-flow条件下的E5-E8中富集（图6C）。在PCL术后2周，小鼠的CDH5+ LCA ECs较RCA有所增加（图6d和6E）。这一结果表明这些转录因子结合基序及其相关转录因子在血小板依赖性调节中具有潜在的重要性。作者还尝试寻找剪切应力反应元件（SSRE），但由于数据库中缺乏定义明确的SSRE转录因子列表而未能成功。作者的研究验证了KLF2/4作为血小板依赖性流动的主要转录因子的作用，同时发现了介导血小板依赖性流动效应的已知和新转录因子。

图6.D-flow改变了关键转录因子的可及性诱导了体内ECs中的STAT1磷酸化

  4. 可及性和共可及性分析揭示了流量依赖的顺式调节相互作用

  为了确定顺式调节元件、增强子区域和共可及性变化的流量依赖调控，作者使用自己的scATAC-seq数据集进行了Cicero分析。对典型的机械敏感性Klf4进行分析，并使用编码基因组浏览器将结果定位到相应的基因位点（图7A）。为了进行这个分析，作者比较了E2（s-flow）和E8（慢性d-flow)集群。与E8相比，E2细胞的顺式元件之间具有更高的共可及性，表明d-flow降低了共可及性连接。接下来，作为其他的例子，作者发现d-flow显著降低了Arl4d启动子区域的可及性（图7Bb）。同样，d-flow也降低了Arl4d的共可及性和基因表达（图7Bc和7Bd）。相反，d-flow增加了Tgfbi的可及性、共可及性和基因表达（图7C）。这些发现表明，流动不仅通过调节TF结合基序，而且还通过改变顺式调节元件来调节基因的表达，以及它们之间的相互作用，提示了表观基因组学和转录机制。

图7 慢性d-flow改变血流敏感基因之间的顺式调节相互作用

  研究结论  

  这项研究通过整合单细胞RNA测序和ATAC测序数据，深入揭示了血流紊乱如何通过表观遗传和转录调控影响内皮细胞的功能。研究发现，血流紊乱不仅改变了内皮细胞的基因表达，还影响了染色质的可及性，导致内皮细胞从抗炎、抗动脉粥样硬化的表型转变为促炎、促动脉粥样硬化的表型。这些发现为理解动脉粥样硬化的发生机制提供了新的视角，并为未来的治疗策略提供了潜在的靶点。

  总结和展望  

  这项研究不仅揭示了内皮细胞在血流紊乱下的复杂变化，还为作者理解动脉粥样硬化的发生机制提供了新的思路。当然，这项研究的意义远不止于此，它还为未来的动脉粥样硬化治疗提供了新的方向，甚至可能帮助作者开发出更有效的药物，让血管细胞重新恢复秩序。说不定有一天，科学家们能通过这些发现，找到治愈动脉粥样硬化的“金钥匙”！

  好了，今天的“血管细胞大揭秘”就到这里啦！通过这篇研究，作者不仅看到了内皮细胞在血流紊乱下的“混乱状态”，还了解到它们如何通过表观遗传和转录调控转变为促炎表型。不得不说，血管真是个复杂的“交通系统”，每个细胞都有自己的职责，而当血流紊乱这个“捣蛋鬼”出现时，整个系统都会陷入混乱。

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参考文献：

Andueza A, Kumar S, Kim J, Kang DW, Mumme HL, Perez JI, Villa-Roel N, Jo H. Endothelial Reprogramming by Disturbed Flow Revealed by Single-Cell RNA and Chromatin Accessibility Study. Cell Rep. 2020 Dec 15;33(11):108491. doi: 10.1016/j.celrep.2020.108491. PMID: 33326796; PMCID: PMC7801938.