研究背景  

  大家好！今天小编要分享的是一篇关于肾脏细胞异质性的重磅研究，题目是《Single cell transcriptional and chromatin accessibility profiling redefine cellular heterogeneity in the adult human kidney》。这项研究的作者将snATAC-seq与snRNA-seq整合分析，显著增强了对成人肾脏细胞多样性和状态动态的解析深度，相比任何单一组学手段都有明显优势。首先，整合分析在细胞鉴定方面做到了优势互补：snRNA-seq提供转录层面的细胞类型特异基因，而snATAC-seq提供表观遗传层面的调控信息。听起来是不是有点复杂？别担心，我们会用最轻松的方式来解读这篇“肾脏细胞大揭秘”的文章！

  想象一下，你的肾脏里有无数个细胞在忙碌工作，有的负责过滤血液，有的负责调节电解质平衡，还有的负责修复损伤。然而，当肾脏疾病来袭时，这些细胞的工作节奏被打乱，甚至有些细胞开始“罢工”。这篇研究就是通过单细胞RNA测序（snRNA-seq）和单细胞ATAC测序（snATAC-seq），深入探讨了这些细胞在健康肾脏和疾病中的“工作状态”和“沟通方式”。

  简单来说，研究人员发现，肾脏中的细胞不仅在基因表达上存在差异，染色质的可及性也发生了显著变化。这些变化导致了细胞功能的紊乱，尤其是近端小管细胞和髓袢升支粗段细胞在肾脏疾病中扮演了重要角色。通过这项研究，科学家们不仅揭示了肾脏细胞的异质性，还为未来肾病的治疗提供了理论支持。

  准备好了吗？让我们一起揭开肾脏细胞背后的秘密吧！！

  主要研究内容  

  1. 人肾脏单细胞转录组和染色质可及性联合图谱

  研究人员对五名健康成年人的肾脏进行了单细胞RNA测序（snRNA-seq）和单细胞ATAC测序（snATAC-seq）（图1a）。通过这两种技术，他们生成了配对的细胞类型特异性染色质可及性和转录组联合图谱。基于谱系特异性标记物的表达（图1c），snRNA-seq鉴定了肾皮质中的所有主要的细胞类型（图1b）。检测到近端小管（PT）、壁上皮细胞（PEC）、髓袢升支粗段（TAL）、远端小管（DCT1、DCT2）、连接小管（CNT）、集合管（PC、ICA、ICB)、内皮细胞（ENDO）、肾小球细胞（MES、PODO）、成纤维细胞（FIB）以及一小群白细胞（LEUK）。值得注意的是，有一个近端小管亚群的VCAM1的表达增加。该亚群也表达了HAVCR1，这是一个在急性损伤后近端小管中上调的基因，是长期肾脏预后的预测因子。snATAC-seq数据集使用97%的一致性阈值进行过滤，以去除双细胞。比较snATAC-seq细胞类型预测（图1d）和无监督聚类的注释（图1e，f）表明，所有主要细胞类型都存在于两个数据集。

  随后，作者使用基于染色质可及性的细胞类型进行了下游分析，这是通过对snATAC-seq数据集的无监督聚类获得的。有趣的是，snATAC-seq能够检测到近端小管簇中的两个亚群，这可能代表了近端卷曲小管（图1e，PCT）和近端直小管（图1e，PST）。PCT在编码葡萄糖钠共转运体2（SGLT2）的SLC5A2中表现出更高的染色质可及性；而PST在编码葡萄糖钠共转运体1（SGLT1）的SLC5A1中表现出更高的可及性（图1f）。SGLT2在近端小管的S1和S2段重新吸收葡萄糖，而SGLT1位于S3。结果显示，snATAC-seq在细胞身份识别方面与snRNA-seq相当，并且能够进一步细化我们对肾单位功能异质性的理解。

图1人肾脏的单细胞转录和染色质可及性联合分析

  2. 细胞类型特异性的染色质可及性差异

  LRP2是一个在近端小管中表达的谱系特异性基因，该区域的覆盖图显示其启动子和基因体内ATAC峰的数量和振幅的增加（图2a）。事实上，大部分染色质可及区域（DAR）位于最近的转录起始位点3 kb内的启动子区域(图2b）。第二常见的位置是内含子，DAR在不同细胞类型中的分布相对保守（图2c）。少数细胞类型特异性的差异表达基因与DAR密切相关（平均比例= 0.358 ± 0.07），这就产生了将功能分配给不位于差异表达基因附近的DAR的问题。调控区域可以通过远程相互作用相互关联，而DAR不一定调控最近的基因。研究发现，大多数差异可及的染色质区域位于启动子附近，并且与差异表达的基因密切相关。通过分析细胞类型特异性转录因子结合motif，研究人员发现NF-κB的激活促进了VCAM1的表达，并驱动了近端小管上皮细胞亚群之间的转变。

图2 细胞类型特异性染色质可及区域的分布

  3. 多模态分析近端小管和髓袢升支粗段的细胞异质性

  研究还发现，近端小管和髓袢升支粗段中存在独特的细胞状态。在snRNA-seq数据集（图3a）中对髓袢升支粗段进行了无监督聚类，以识别三组细胞。第一组细胞（SLC12A1+UMOD+）表达髓袢升支粗段标记物（CLDN16、KCNJ10和PTH1R）： TAL1，第二组表达另一组TAL特异性标记物，如CLDN10：TAL2（图3b）。根据先前发表的标记物的表达，第三组细胞被确定为升支细段（ATL）。作者使用免疫组化方法验证了PTH1R和KCNJ10在UMOD+ SLC12A1+细胞亚群中表达（图3c）。分析了snATACseq数据集中的髓袢升支簇，并确定了三组符合作者在snRNA-seq数据集中发现的细胞（图4d，e）。我们的研究结果表明，髓袢升支亚群可以通过转录或染色质可及性谱来定义。作者使用Seurat FindMarkers和chromVAR来识别相对于其他TAL细胞，任一 TAL 亚群中 HNF1B 或 ESRRB 转录因子motif活性的增加（Bonferroni Padj<0.05）（图4f）。随后，作者使用SeuratFind标记物功能来识别区分髓袢升支细胞群的DAR，并使用Seurat FindMotifs功能对这些DAR进行转录因子motif富集（图4g）。通过多组学分析，研究人员能够更准确地检测这些细胞状态，并重新定义了这些区域的细胞异质性。这些发现可能对肾脏再生和细胞特异性阳离子通透性有重要影响。

图3 髓袢升支粗段的转录和表观遗传异质性

  4. 鉴定新型表达VCAM1的近端小管细胞亚群

  研究人员还鉴定出一个表达VCAM1的新型近端小管细胞亚群（PT_VCAM1），这些细胞在急性肾损伤和慢性肾脏疾病中比例增加。其对VCAM1的表达和染色质可及性增加，作者将其命名为PT_VCAM1（图1）。免疫荧光研究显示VCAM1表达在近端小管上皮中分散分布（图4a）。作者的单细胞研究估计PT_VCAM1占总细胞的2%和近端小管上皮的6%。作者还证实，在4.19 ± 1.58%的LTL+ PT细胞中观察到了VCAM1+小管细胞，而在肾皮质的UMOD+ TAL细胞中未检测到VCAM1+细胞（图4b）。虽然先前的研究表明VCAM1在降肢Henle环（dTL）中表达，但作者通过用AQP1染色肾脏切片观察到VCAM1仅在dTL的一小部分中表达（图4c）。PT_VCAM1也表达了VIM（波形蛋白）、CD24和CD133，这与之前描述的在近端小管中具有祖细胞样特征的细胞群相一致。在免疫荧光分析中，作者确定了VCAM1+近端肾小管细胞的一个亚群表达CD24或CD133（图4d）。通过伪时间轨迹分析，研究人员发现NF-κB信号通路在这一细胞亚群中发挥了重要作用。

图4 表达VCAM1的近端肾小管细胞亚群的鉴定

  5. VCAM1+近端小管细胞在肾病中发挥重要作用

  作者通过 chromVAR 分析发现，在PT_VCAM1亚群中：HNF4A motif活性显著降低：HNF4A是维持成熟PT细胞特性的关键转录因子。NF-κB 家族转录因子（如RELA）motif活性显著升高：提示有炎症信号的激活，可能是诱导VCAM1表达的直接原因。这说明PT细胞从成熟状态向VCAM1阳性状态转化的过程，伴随着HNF4A被抑制、NF-κB被激活，存在一个调控“开关”。

  而使用 Cicero 共可及性分析，作者发现：在VCAM1基因下游约60 kb处存在一个显著的开放染色质区域（可能为远程增强子）。该区域具有 RELA/NF-κB motif，并与VCAM1启动子共可及（即在同一细胞中倾向于同时开放）。ChIP-qPCR 实验 进一步验证：在肾近端小管细胞中，RELA蛋白确实结合于这个远程元件。这一结果强有力地支持了：NF-κB 直接驱动 VCAM1 的转录激活，可能通过远程增强子与启动子形成三维互作。

图5 急性和慢性肾病中VCAM1+近端小管细胞的比例增加

  本研究重要结论  

  这项研究通过整合单细胞转录组和染色质可及性数据，深入揭示了成年人类肾脏中细胞异质性和基因调控网络的复杂性。以下是本研究的主要发现和贡献：

  1. 细胞类型特异性染色质可及性：研究发现了不同细胞类型之间的染色质可及性差异，这些差异与基因表达密切相关。

  2. 转录因子的调控作用：NF-κB等转录因子在近端小管细胞的功能转变中发挥了关键作用。

  3. 肾脏疾病的细胞异质性：研究揭示了近端小管和髓袢升支粗段细胞在肾脏疾病中的独特状态，为未来的治疗提供了新的潜在靶点。

  总结和展望  

  这项研究不仅提供了肾脏细胞异质性的全面视角，还为未来肾病的治疗策略提供了新的潜在靶点。通过整合多组学数据，研究人员揭示了肾脏细胞在健康和疾病中的复杂调控机制，为理解肾脏疾病提供了重要的见解。未来的研究可以进一步探索这些调控机制，并开发针对特定细胞类型和基因模块的治疗方法。当然，单细胞多组学也带来了数据整合和分析的新挑战，但这些挑战正推动方法学的创新。展望未来，随着测序技术和分析工具的不断发展，多模态单细胞测序将更为普及和高效。其在肾脏等复杂器官研究中的应用前景广阔：不仅可用于绘制更全面的细胞图谱，也可用于监测疾病进展、评估治疗响应，甚至指导个体化治疗策略。

  好了，今天的“肾脏细胞大揭秘”介绍到这里就接近尾声啦！通过这篇研究，我们不仅看到了肾脏细胞的“工作状态”，还了解到它们在疾病中的关键作用。不得不说，肾脏真是个复杂的“工厂”，每个细胞都有自己的职责，而当疾病这个“捣蛋鬼”出现时，整个系统都会陷入混乱。

  当然，这项研究的意义远不止于此。它为未来的肾脏疾病治疗提供了新的方向，甚至可能帮助我们开发出更有效的药物，让肾脏细胞重新恢复秩序。说不定有一天，科学家们能通过这些发现，找到治愈肾脏疾病的“金钥匙”！

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  我们下期再见！

  参考文献：

  Muto Y, Wilson PC, Ledru N, Wu H, Dimke H, Waikar SS, Humphreys BD. Single cell transcriptional and chromatin accessibility profiling redefine cellular heterogeneity in the adult human kidney. Nat Commun. 2021 Apr 13;12(1):2190. doi: 10.1038/s41467-021-22368-w. PMID: 33850129; PMCID: PMC8044133.