相对于常见疾病，治疗罕见病的药物，也称为孤儿药的研发面临独特而重大的挑战。主要的困难点，从患者招募角度来看包括患者人数少且有可能地理分布上比较分散，因此找到足够多的合格受试者是临床开发最大的障碍；同时由于罕见病临床试验样本量不可能太高，那些具有大型对照组的传统随机对照试验（RCT）通常在统计学上效力不足或伦理上存在问题（剥夺患者潜在的治疗）；进行这类临床试验通常需要具有罕见病专业知识的中心，这些有资质的中心也是有限的，进而这也会引发物流上的挑战和患者需要长途旅行到临床中心的困难。除了临床试验方面，孤儿药的投资回报率可能也没有常见疾病高，这进一步限制了孤儿药开发。

  为了应对上述挑战，创新的临床试验设计和灵活的监管批准路径应运而生。我们在以前的文章中介绍过混合对照臂设计

  从临床试验对照臂的数据来源分，传统 RCT 拥有在同一临床试验中设立的内部对照臂；外部对照臂则完全依赖外部数据（如历史试验、真实世界数据）构建的对照臂，未包含当前试验的受试者；而混合对照臂介于两者之间，它由内部数据（当前试验部分患者的数据）与外部数据（如历史试验或并行的 RCT 数据）的结合所构建。

  王燕生，公众号：有理就听你的

  复杂创新临床试验设计及案例介绍

  这次我们来介绍一个使用外部对照臂，只用一个“充分且良好对照临床试验”（Adequate and Well Controlled Trials）加上基于 PD 和机理的“确证性证据”（Confirmatory Evidence）获得 FDA 批准的孤儿药。这个药就是 Alnylam 的 Vutrisiran，它所借助的药物是同属 siRNA 的 Patisiran，这两个药物除了递送方式，本身的机理是非常类似的。

  因此为了介绍这个案例，我们先来简单介绍一下 siRNA 这种新型药物模式，然后介绍 Patisiran 的背景情况，FDA 对一个外部对照研究提供获批所需“实质性证据”（Substantial Evidence）评估的要求，最后是 Vutrisiran 获批的案例。

  siRNA 简介

  RNA 干扰（RNAi）是一种进化上保守的内源性过程，用于基因表达的转录后调控。以序列特异性方式沉默靶 RNA 的主要调节 RNA 类别包括小干扰 RNA（siRNA）和 microRNA（miRNA）。其中第一类 siRNA，是 21 或 22 核苷酸双链 RNA（dsRNA），可以在哺乳动物细胞中诱导 RNA 沉默，而不会引起非特异性干扰素反应。

  siRNA 的机理如下图所示，在此我们只关注图右边外源的合成 siRNA 的作用机理。合成的 siRNA 可以直接与 RNA 诱导沉默复合物（RISC）结合，通过碱基对互补介导对靶 mRNA 进行识别。然后 RISC 复合物中的 Argonaute 2 酶切靶 mRNA，导致靶基因敲低。

  下图是我几年前写的幻灯片中的一张图，只截止到 2021 年有关 siRNA 的历史，更近的药物批准没有更新上，不过主要需要提到的点还是相对比较齐全的。RNA 干扰现象最早是在 1998 年由 Andrew Fire 和 Craig Mello 两位科学家在秀丽隐杆线虫上发现的，他们也因此于 2006 年获得诺贝尔奖。

  作为生物学工具，RNAi 或者更具体些的 siRNA 立即获得学术界的广泛关注，但是作为治疗疾病的药物，siRNA 所面临的最大挑战就是递送问题。从 2006 年开始，人们通过脂质体纳米颗粒技术尝试进行 siRNA 的递送。2014 年人们又开始进行 N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）与 siRNA 偶联技术的研发。

2018 年第一个 siRNA 药物 Patisiran 获得 FDA 批准，适应症是遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性引起的多发性神经病，该药物由 Alnylam 研发。而治疗高血脂的英克司兰分别在 2020 年，2021 年和 2023 年被 EMA，FDA 和我国药监局批准上市，这也是我国第一个上市的 siRNA 药物。

  下面我们来说一下 siRNA 这种药物模式的优势和挑战。首先，从理论上讲 siRNA 可以下调任何致病基因，特别是包括那些被传统药物模式视为“不可成药”的疾病靶点。其次，siRNA 相对是更容易程序化设计的，也就是说针对给定靶基因的 siRNA 可以通过计算机和体外实验进行筛选，其成功率远比蛋白靶点的药物高得多。最后，通常 siRNA 具有非常长的药效学效应，比如上面提到的英克司兰，可以做到每半年皮下注射一次，长效降脂。

  当然 siRNA 成药也有很多挑战。首先是脱靶问题，由于前面讲到的 siRNA 由 21 或 22 核苷酸组成的双链 RNA，核苷酸数量不算很多也就潜在可能与脱靶 mRNA 的片段结合引起序列相关脱靶效应，当然也有些与序列不太相关的脱靶效应。为了应对该脱靶效应，一般是需要进行更细致的序列筛选。其次是稳定性问题，天然的 siRNA 易受内源性 RNase 的影响，从而在体循环中被降解。解决方法是对核苷酸进行化学修饰以提高稳定性。最后也是最重要的是递送问题，由于 siRNA 的大小约为 15 kDa 并且带有负电荷，不易穿过细胞膜，不能透膜也就无法在细胞质中对靶 mRNA 进行沉默产生药理作用。目前成功的递送方法是脂质体纳米颗粒（LNP）和 N-乙酰半乳糖胺偶联（GalNAc）。我们下面更加细致地介绍一下这两种方法。

  首先是脂质体纳米颗粒递送技术。适用于 siRNA 递送的脂质体纳米颗粒是由阳离子脂质，中性脂质，磷脂，胆固醇和聚乙二醇化（PEG）脂质组成，这些组分在酸性 pH 值条件下与 siRNA 组装成脂质纳米颗粒。在给药后，载脂蛋白 E 吸附到 LNP 表面，并通过肝细胞表达的低密度脂蛋白受体（LDLR）促进内化，进而从内体逃逸到细胞质进行基因敲低作用。

  而 N-乙酰半乳糖胺偶联采取了更为聪明的方法进行递送。肝细胞表面高度特异表达去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR），该受体是三聚体，可以与 N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）高效力结合。下图是 Anlylam 专利的 L96 分子结构，由三价 GalNAc 形成三叉戟形式，并由连接子与 siRNA 链接。唾液酸糖蛋白受体与 GalNAc-siRNA 偶联分子结合后，通过内吞作用进入细胞，从内体逃逸后与靶 mRNA 作用。

  遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性和第一个 siRNA 药物 Patisiran

  遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性（hATTR）是一种由转甲状腺素蛋白（TTR）基因突变引起的常染色体显性遗传病。TTR 基因中的 120 多种不同点突变导致蛋白质错误折叠、聚集和沉积，从而引起多系统疾病表现，特别是它会影响心脏和周身及中枢神经系统。在 30 位的蛋氨酸取代缬氨酸（V30M）是导致 hATTR 淀粉样变性的最常见突变。

  hATTR 的症状通常发生在 20 至 70 岁之间，在发病后 5 至 12 年内会引起死亡，最常见的死亡原因是心脏功能不全、感染或恶病质。许多患者因存在周围神经病变和自主神经功能障碍而出现明显的神经病变（简称 hATTR-PN）。

  hATTR 是一种罕见病，据估计全球的发病人数约为五万人，其中 hATTR-PN 的全球患病率估计在 5,000 至 10,000 人之间。

  Patisiran 是 Alnylam 开发的一种 LNP 递送 siRNA。为了获批 hATTR-PN 适应症，Alnylam 进行了一项 APOLLO 研究，其临床试验设计如下所示。这是一项随机，双盲，安慰剂对照临床试验，遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性伴多发性神经病变患者以 2:1 的比例，每 3 周接受一次静脉注射 patisiran 或安慰剂。主要终点是改良神经病变损伤评分 +7 相对于基线的变化（mNIS+7），次要终点包括 Norfolk 生活质量-糖尿病神经病变问卷（Norfolk QOL-DN）、10 米步行测试和改良体重指数等。

  我们先来看看该研究的 PD 指标数据[1]，即血清转甲状腺素蛋白水平降低。可以看到在 patisiran 组中，患者的血清转甲状腺素蛋白水平下降迅速并持续 18 个月。

  然后我们来看看 APOLLO 研究的主要有效性数据[1]。在 18 个月时， patisiran 组 mNIS+7 相对于基线的最小二乘平均值（±SE）变化为 -6.0±1.7，而安慰剂组为 28.0±2.6（最小二乘平均差，-34.0 分；95% CI，-39.9 至 -28.1；P<0.001）。并且 Patisiran 对 mNIS+7 的影响早在 9 个月时就已看到。同样，18 个月时，patisiran 组的 Norfolk QOL-DN 评分相对于基线的变化显著低于安慰剂组，表明 patisiran 组患者的生活质量得到改善。其他次要终点的指标也都达标了，这里就不一一列举。

  由于上述临床试验数据并结合获益-风险评估，FDA 批准了 patisiran 上市。

  FDA 关于药品批准实质性证据的要求

  “实质性证据”是美国食品和药物管理局（FDA）批准新药上市所需的法律标准。《联邦食品、药品和化妆品法案》（FD&C Act）第 505(d) 条明确定义为：“由经过科学培训和经验的专家进行充分和良好对照的调查，包括临床调查，以评估所涉药物的有效性证据，据此，这些专家可以公平和负责任地得出结论，该药物在规定或建议的使用条件下将具有其标签中宣称的效果”。传统上，FDA 几乎总是要求至少两项充分且良好对照的研究来证明有效性，这提供了对临床试验结果的可重复性和可信度。

  FDA 认识到在罕见病中进行传统随机对照试验存在伦理和实践挑战，因此在 CFR 章节 314.105(c) 及其行业指南[2]，指南草案[3]中规定，在“某些情况下”，如果单一“充分和良好对照的”临床试验提供对“有效性的有说服力的证据”并且提供了“确证性证据”时，FDA 可以接受两方面证据合在一起提供了上市必须的“实质性证据”。

  下面我们详细地解释一下 FDA 对“某些情况下”，“充分和良好对照的临床试验”，以及“确证性证据”的定义。掌握这些定义才能与 FDA 进行沟通和讨论，并指导我们制定临床开发策略。下面与我们案例相关的重点使用了加粗来进行醒目提示。

  首先是什么叫做“充分和良好对照的”试验，在以前咱们的公众号文章中只是做了非常粗略的说明，下面是 21 CFR 314.126 节中的定义：

  ● 明确说明试验目标和分析方法

  ● 设计允许与对照进行有效比较

  ● 采取适当措施尽量减少受试者分配到治疗组的偏倚

  ● 采取适当措施尽量减少受试者、观察者和分析者对数据的偏倚

  ● 定义明确且可靠的响应评估方法

  ● 对研究结果进行充分分析以评估药物的效果

  其次是“确证性证据”都包括哪些研究的证据？下面的定义来源于[3]：

  ● 已有“充分和良好对照的”研究证明药物在密切相关适应症中的有效性

  ● 提供强有力的机理支持数据（例如，PD 标志物数据、动物模型等）

  ● 来自相关动物模型的数据

  ● 自然疾病史来源的其他数据

  ● 同一药理学类别中其他药物有效性的科学知识

  ● 真实世界数据/证据

  ● 同情用药数据

  最后是在什么情况下，单一“充分和良好对照的”临床试验加上“确证性证据”足够建立有效性的“实质性证据”？这个接受原则主要是一下四方面：

  ● 单一充分且良好对照的试验结果具有说服力

  ● 稳健的“确证性证据”

  ● 疾病的严重性和未满足的医疗需求

  ● 进行额外试验的伦理和实践具有挑战

  由于我们的案例使用了外部对照，根据 ICH E10，“此类研究中（指的是外部对照研究）进行的统计显著性检验不如随机试验可靠”。因此，为了让外部对照研究达到“充分和良好对照的”试验的标准，FDA 在其指南草案[4]中建议外部对照研究的适用性为以下四点：

  ● 明确的自然病史

  ● 外部对照人群与治疗组非常相似

  ● 影响主要终点的伴随治疗没有实质性差异

  ● 预计治疗效果很大

  下面我们介绍一下 Vutrisiran 的案例，看一下它是如何符合上述条件而获得“实质性证据”的。

  Vutrisiran 的监管批准途径

  Vutrisiran 的首个 NDA 获批的适应症和 patisiran 一样都是 hATTR-PN，我们简单回顾一下这个疾病，它是一种罕见的威胁生存的疾病。患者群体少、异质性和进展迅速支持其临床开发可以合理应用灵活的试验设计。

  在 Vutrisiran 获批前，hATTR-PN 的治疗药物只有 patisiran 和反义核苷酸药物 inotersen。但是，Patisiran 必须每 3 周静脉输注一次，并带有输液相关反应的警告。而由于存在血小板减少症和肾小球肾炎的风险，Inotersen 只能通过限制性分销计划获得。辉瑞的 Tafamidis 被批准用于治疗 hATTR 淀粉样变性的心肌病，但未被批准用于治疗 hATTR-PN。因此，hATTR-PN 患者依然存在高度未满足的临床需求。

  从机理角度来看，Patisiran 和 Vutrisiran 具有相似的作用机制，通过 RISC 途径降解 TTR mRNA 来减少 TTR 蛋白的产生。它们的区别在于 Patisiran 是通过 LNP 来递送，而 Vutrisiran 是通过更先进的 GalNAc 偶联来递送。产生的临床给药区别在于 Patisiran 每 3 周静脉输注一次，而 Vutrisiran 每 3 个月皮下注射一次，依从性上大大提高。

  我们来看看 Vutrisiran 的关键临床研究 HELIOS-A 试验设计，这是一项 3 期开放标签研究，比较了 vutrisiran 与一个 APOLLO 研究安慰剂组作为外部对照的疗效和安全性。患者以 3:1 比例随机分配至每 3 个月（Q3M）皮下注射 25 毫克 vutrisiran 或每 3 周（Q3W）静脉注射 0.3 毫克/千克 patisiran，治疗期持续 18 个月。主要终点是在第 9 个月与 APOLLO 研究的安慰剂组（外部安慰剂组）相比，改良神经病变损伤评分 +7 相对于基线的变化（mNIS+7）。关键次要终点也和 APOLLO 研究一样是 Norfolk 生活质量-糖尿病神经病变问卷（Norfolk QOL-DN）。另外，该研究还在试验内部比较了 18 个月时 Patisiran 组和 Vutrisiran 组的血清 TTR 水平百分比。

  我们先对着 FDA 指南看看外部对照研究的适用性。首先，hATTR-PN 的自然病史比较清晰，致病机理和预后都由足够的证据进行支持。其次，APOLLO 和 HELIOS-A 研究的入组标准相似。再次，除了招募相似的患者群体外，这两项研究还评估了相似的终点。最后，vutrisiran 和 patisiran 属于同一药理学类别，因此预计 vutrisiran 的疗效应与 patisiran 观察到的疗效相当都很大。这四点支持可以使用外部对照研究。

  我们来看一下这个试验的结果[5]，首先是主要终点 mNIS+7 和关键次要终点 Norfolk QOL-DN。无论是主要分析的 9 个月时，还是更长的随访 18 个月时，相对于基线 mNIS+7（48.3% [vutrisiran] vs 3.9% [外部对照安慰剂]）和 Norfolk QOL-DN（56.8% vs 10.4%），vutrisiran 都有高度统计学显著和临床意义的改善。

  在 HELIOS-A 试验内部的药效动力学对比中，18 个月时在研究内 Patisiran 组和 Vutrisiran 组观察到类似的血清 TTR 水平百分比下降情况。

  HELIOS-A 研究作为单一“充分和良好对照的”临床试验提供了有效性的有说服力的证据，想建立药品获批有效性的“实质性证据”，还需要稳健的 “确证性证据”。Vutrisiran 的“确证性证据”是由两方面的信息组成的：一方面是机理支持数据，即血清 TTR 降低与 vutrisiran 的 siRNA 机理一致，并且 patisiran 组也观察到类似的 TTR 降低；另一方面是科学知识，也就是来自 patisiran（同一药物类别）的先前疗效数据。

  最终，Alnylam 通过一项有说服力的临床试验数据，加上基于机理和科学知识的确证性证据，提供了 vutrisiran 上市必要的有效性实质性证据。

  总结

  Vutrisiran 的批准体现了 FDA 对罕见病的灵活监管态度。与外部对照的单一临床试验和机理的确证性证据相结合提供实质性证据的成功取决于：

  1.通过 FDA 早期参与试验设计，确保设计符合“充分和良好对照的”要求。

  2.研究结果为 vutrisiran 治疗 hATTR-PN 疗效的主要及次要终点上提供了具有统计学显著和临床意义的证据。

  3.使用科学知识（patisiran 的先前数据）和药效学终点（TTR 水平降低）来提供确证性证据。

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  参考文献

  1.N Engl J Med 2018;379:11-21.

  2.FDA guidance for industry, Demonstrating Substantial Evidence of Effectiveness for Human Drug and Biological Products, (2019).

  3.Demonstrating Substantial Evidence of Effectiveness With One Adequate and Well-Controlled Clinical Investigation and Confirmatory Evidence, Draft Guidance for Industry, September 2023.

  4.FDA Draft Guidance: Considerations for the Design and Conduct of Externally Controlled Trials for Drug and Biological Products, 2023.

  5.Amyloid. 2023 Mar;30(1):1-9.