动植物特殊物种的单细胞注释方法讨论

  单细胞测序技术已广泛应用于人类、小鼠等模式物种，但在动植物特殊物种中，由于基因组注释不完善、研究较少等原因，在数据质控、细胞类型注释和功能分析等环节仍面临诸多挑战。本文将简要梳理特殊物种单细胞注释的常用思路和方法，帮助您快速了解相关内容。

  本文将分别介绍非人鼠哺乳动物和植物的细胞注释方法，并补充同源基因转换和特殊物种的富集分析思路。文中涉及的参考文献已在文末列出，便于进一步查阅。随着领域不断发展，相关方法也在不断丰富，欢迎与我们交流探讨。

  细胞注释方法        

                          Part.1

   1. 非人鼠哺乳动物  

  对于动物研究，除人类和小鼠外，还有一些物种（如斑马鱼、线虫、果蝇等）已有较多研究，这类物种可以直接参考同物种的相关文献。例如，研究果蝇心脏发育的单细胞文章就参考了果蝇的相关基因特征 [1]。然而，对于如鸡、牛、海鞘等研究相对较少的非模式物种，细胞注释可参考以下方法：

    1.1  marker基因注释

  优先查找同物种文献：如有同物种的单细胞研究，优先参考其细胞注释所用的marker基因。

  参考近缘或模式物种：如同物种资料不足，可借鉴近缘或模式物种的相关文章，动物也可直接参考人/鼠的同源基因。

  结合保守基因功能：如以上均不能满足，可关注在未知细胞群中特异表达的基因，结合其已知功能特征推断细胞类型。一些具有保守功能或表达特征的基因也可作为参考。例如，研究鸡发育过程的单细胞文章就利用了保守基因进行注释[2]。

   1.2   同源基因转换

  将该物种的基因转换为人类等研究较多物种的同源基因，再用这些基因进行细胞注释。这样可以充分利用人类丰富的基因功能和表达信息。例如，鸡视网膜的单细胞研究在跨物种比较时就采用了同源基因转换[3]。

    1.3   差异基因富集分析

  对每个细胞群的差异基因进行功能富集分析（如GO/KEGG），结合富集结果描述细胞群特征。此方法主观性较强，但在缺乏注释信息时非常有用。通常先获得各未知细胞群的差异基因，再进行单基因或基因集的通路富集分析，结合富集结果来描述和定义细胞群特征。

    2.植物  

    2.1   marker基因注释

  优先查找同物种文献：如有同物种的单细胞研究，优先参考其细胞注释所用的marker基因。例如，拟南芥数据可直接参考其经典marker基因，并结合基因集打分等方法[4]。

  需注意，不同基因组版本的差异可能带来额外困难，如基因注释不一致、基因名不同等，建议提前核查。

  参考近缘或模式物种：如同物种资料不足，可借鉴近缘或模式物种的相关文章。例如，油茶可参考茶树或拟南芥的相关研究[5]。

  结合保守基因功能：如以上均不能满足，可关注在未知细胞群中特异表达的基因，结合其已知功能特征推断细胞类型，例如保守基因的功能特征。

    2.2   同源基因转换

  将该物种基因转换为拟南芥等模式植物的同源基因，利用其丰富的表达信息和功能注释，作为参考。

    2.3   差异基因富集分析

  同样地，对于研究较少的物种，可通过富集分析确定细胞群特征[5]。先获得各未知细胞群的差异基因，再进行单基因或基因集的通路富集分析，结合富集结果描述和定义细胞群特征。

   2.4   实验验证

  如条件允许，可对未知细胞群的top差异基因进行RNA原位杂交等实验，直接验证基因表达分布。

  例如，一篇研究水稻的文章参考了经典marker，并结合原位杂交实验来定义部分细胞群[6]。

    3. 注释结果的验证  

  可以利用公共数据来辅助判断注释的可靠性。例如，可以计算细胞群与公共数据的表达相似性[7]；也可以基于微阵列数据的基因表达信息来验证细胞注释结果[8]；Wendrich等人将细胞群的top20差异基因与公共数据进行比较来确定细胞类型[9]。

  若存在已注释好的细胞类型表达谱，也可以通过SingleR、CellTypist等工具来自动注释。进一步，也可与已知细胞类型的单细胞数据进行整合分析，提高注释准确性。

  同源基因转换方法

Part.2

  下面介绍几种常用的同源基因转换方法。

  1. 代码工具  

  biomaRt：R包，支持Ensembl数据库的跨物种基因同源转换（支持125个动物类别和233个植物类别）。

  homologene：R包，基于NCBI HomoloGene数据库，支持基因同源映射（支持21个物种）。

  babelgene：R包，聚合多数据库信息，支持基因同源映射（支持19个物种）。

  2. 在线工具  

  可以通过Ensembl数据库的biomaRt在线工具来进行转换。

  Ensembl（https://www.ensembl.org/biomart/martview/37577e83a2122c2022f1abb8c703591f）

  Ensembl plants

  （https://plants.ensembl.org/biomart/martview/1a9c766c1ea21107b6beea921a4a8487）

  3. 序列比对  

  数据库里能够进行同源转化的物种是有限的。对于数据库不支持的物种，可用BLAST等工具进行序列比对，结合InterProScan等工具预测蛋白功能。

  特殊物种的富集分析

Part.3

  特殊物种在富集分析上也有一些常用手段。常见富集分析工具需要相应的注释数据，例如：Bioconductor的OrgDb，但该数据库目前仅包含了20个物种的注释数据集。对于数据库不支持的物种，可以首先尝试同源转换；其次也可以考虑用InterProScan、KOBAS等工具手动构建注释库，即先进行序列比对和功能注释，再进行GO/KEGG富集分析。

  结语：

  特殊物种的单细胞注释虽然面临挑战，但通过参考文献、同源基因转换和功能富集等方法，依然可以获得较为可靠的注释结果。希望本文能为您提供实用的参考。

  参考文献：

  1. Huang X, Fu Y, Lee H, et al. Single-cell profiling of the developing embryonic heart in Drosophila.Development.2023;150(16):dev201936. doi:10.1242/dev.201936.

  2. Williams RM, Lukoseviciute M, Sauka-Spengler T, Bronner ME. Single-cell atlas of early chick development reveals gradual segregation of neural crest lineage from the neural plate border during neurulation. Elife. 2022;11:e74464. Published 2022 Jan 28.  doi:10.7554/eLife.74464.

  3. Yamagata M, Yan W, Sanes JR. A cell atlas of the chick retina based on single-cell transcriptomics. Elife. 2021;10:e63907. Published 2021 Jan 4. doi:10.7554/eLife.63907.

  4. Yin R, Chen R, Xia K, Xu X. A single-cell transcriptome atlas reveals the trajectory of early cell fate transition during callus induction in Arabidopsis. Plant Commun. 2024;5(8):100941.doi:10.1016/j.xplc.2024.100941.

  5. Zhao S, Rong J. Single-cell RNA-seq reveals a link of ovule abortion and sugar transport in Camellia oleifera. Front Plant Sci. 2024;15:1274013. Published 2024 Feb 2.doi:10.3389/fpls.2024.1274013.

  6. Zhang TQ, Chen Y, Liu Y, Lin WH, Wang JW. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nat Commun.2021;12(1):2053. Published 2021 Apr 6. doi:10.1038/s41467-021-22352-4.

  7. Brown CC, Gudjonson H, Pritykin Y, et al. Transcriptional Basis of Mouse and Human Dendritic Cell Heterogeneity. Cell. 2019;179(4):846-863.e24. doi:10.1016/j.cell.2019.09.035.

  8. Jean-Baptiste K, McFaline-Figueroa JL, Alexandre CM, et al. Dynamics of Gene Expression in Single Root Cells of Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 2019;31(5):993-1011.doi:10.1105/tpc.18.00785.

  9. Wendrich JR, Yang B, Vandamme N, et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.Science.2020;370(6518):eaay4970.doi:10.1126/science.aay4970.