微生物可能通过影响免疫反应、促进炎症反应、产生致癌物质等方式，影响癌症的发生、发展和转移。有研究发现细胞内的细菌并不是随机分布的，而是在具有免疫和上皮细胞功能的微小细胞中会高度组织化，进而促进癌症进展。然而，由于受胞内菌检测技术水平的限制，目前胞内菌的研究极少。亟需借助高通量测序技术辅助研究宿主-微生物互作关系。

  居住在细胞内的细菌对人类构成了很大的挑战，被证明是一个异常顽固的麻烦。一些感染性细菌，如Staphylococcus aureus、Listeria monocytogenes和Salmonella typhimurium，表现出显著的逃避抗生素和免疫细胞杀伤的能力。它们隐藏在哺乳动物细胞中，包括负责消灭细菌的巨噬细胞。在这种情况下，巨噬细胞不仅不能消灭细菌，而且成为细菌繁殖的来源，使细菌从最初的感染部位扩散并侵入组织内各种非吞噬细胞类型。细胞内细菌与各种严重疾病有关，包括败血症、骨髓炎和癌症转移。不幸的是，治疗失败和复发是常见的。无法快速准确地识别特定类型的细菌，阻碍了及时准确的对症治疗。但胞内菌的研究目前很少，技术的应用仍面临着巨大的挑战。

  用于检测细胞内细菌的传统方法包括微生物培养、透射电子显微镜、聚合酶链反应、免疫荧光染色和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱。其中大多数需要裂解宿主细胞，然后检测其中的病原体。这些技术操作复杂、依赖经验、技术娴熟、耗时等问题，不能满足大量细胞的检测。

图1：共聚焦显微镜和透射电镜（TEM）图像

鉴定巨噬细胞和成骨细胞内的金黄色葡萄球菌

  近年来，研究人员开发了新的荧光探针，可以直接看到细胞内的细菌，而不需要细胞裂解。例如，一些设计的探针可以结合感染细胞中过度表达的caspase-1，从而激活荧光。对Staphylococcus aureus的双重识别单元修饰了的纳米探针（包括适配体和teicoplanin），已被用于细胞内Staphylococcus aureus的特异性检测。Rotello等人也报道了一种用于细胞内细菌鉴别的纳米传感器技术。然而，这些探针不能区分细胞内的细菌种类，而是主要集中在确定感染的存在。因此，迫切需要开发一种简单、快速、准确、高通量的方法来鉴定细胞内细菌种类。

图2：基于FRET纳米探针检测金黄色葡萄球菌

  基于高通量测序技术的胞内菌鉴定方法                                                                                        NO.1

  随着二代测序技术的发展，扩增子测序、宏基因组学技术被应用鉴定不同肿瘤内的菌群组成、多样性及其功能，但其针对的是整个肿瘤环境中的微生物，无法区分细胞内微生物。此外，单细胞测序技术的突破，使得微生物的研究也进入到单细胞水平，用于解析群落的异质性和未培养微生物的功能。但目前的应用主要集中在培养的菌株。虽然这些技术突破促进了瘤内微生物群的生物学研究的发展，但它们获取的是单一的细菌信息，肿瘤中与之相互作用的特定宿主细胞类型尚未完全揭示。而单细胞转录组技术却可以解析宿主细胞的功能，将16s rRNA技术和scRNA融合的双scRNA-seq技术，显示出在阐明宿主-微生物相互作用方面的巨大潜力。已有的单细胞胞内菌相关报道显示，这些研究一方面借助生物信息学技术挖掘单细胞数据内的微生物信息，一方面借助单细胞转录组技术原理，在单细胞水平实现检测宿主基因表达的同时可以鉴定胞内微生物的组成。接下来，让我们一起了解下单细胞胞内菌的研究进展：

  1.基于生物信息学方法解锁单细胞数据内隐藏的微生物信息

  虽然基于单细胞捕获原理，获得的数据基本是宿主转录组的信息，但是仍有少数微生物信息可以被捕获，解锁这些不到1%的微生物隐藏信息，有助于直接挖掘微生物-宿主之间的互作关系。

  这篇2022年的研究中开发了一种单细胞分析方法（SAHMI），这种方法可以从宿主组织的单细胞测序数据中识别出微生物信息。结果显示，胰腺癌肿瘤细胞具有最多和最强的细菌富集，这些细菌是胞内菌，影响肿瘤细胞的多样性，差异表达基因和通路富集分析显示胞内菌通过影响基因表达影响肿瘤恶性进展。含胞内菌胰腺癌肿瘤微环境中的T细胞是响应感染的T细胞，这一发现为胰腺癌为什么具有高水平的炎症而对免疫治疗反应不佳提供了解释。生存分析也显示含胞内菌的胰腺癌与总生存率显著降低有关。

图3:胰腺癌样本中细胞内细菌组成和分布差异

  此外，2024年发表的一篇文章，开发了一种新的计算方法CSI-Microbes，对比SAHMI方法在识别微生物reads方面的灵敏度更高。该方法适用于不同单细胞测序技术产生的数据集，假阳性率低，并通过应用CSI-Microbes方法发现髓系细胞内的细菌reads富集现象。

图4：比较不同技术下的微生物捕获率

  2.基于单细胞捕获平台富集胞内微生物

  为了提高胞内细菌信息捕获的能力，有研究在单细胞转录组技术的基础上，开发了一种细菌富集的方法-INVADE-seq，将16S rRNA的RT引物加入到油包水体系中，利用凝胶微珠同时捕获宿主细胞基因和细菌16S rRNA序列，再通过引物进一步扩增富集，通过共有cell barcode信息，实现细胞与细菌的映射。通过该技术实现在单细胞层面细菌与宿主细胞的直接互作机制，发现具核梭菌与密螺旋菌属细菌主要分布于肿瘤上皮细胞和单核巨噬细胞亚群中，细菌感染显著激活了与癌症进展相关通路，而巨噬细胞中参与炎症反应的基因表达水平增加。

图5：INVADE-seq技术原理

  然而INVADE-seq技术也存在一些挑战，因遵循5'端单细胞RNA测序标准流程，需最大化哺乳动物细胞存活率，且未对细胞裂解步骤进行修改以增强革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌细胞的裂解效果，鉴定出的细菌相关细胞数量有限，细菌UMI计数偏低。

  创新单细胞  胞内菌技术解析微生物与宿主的互作                                                                        NO.2

  寻因生物SeekOne® DD 单细胞转录组+HS胞内菌测序技术是基于SeekOne® DD油包水技术平台完成的，通过体外细胞固定透化加入溶菌酶破坏细菌的细胞壁使细菌释放出更多rRNA，打破革兰氏阳性菌检测壁垒，加入RNA RT Primer和16S RT Primer进行体外逆转录之后再通过油包水实现单细胞分离，利用核酸修饰的Barcoded Beads对不同细胞来源的RNA分别进行分子标记，凝胶微珠同时捕获宿主细胞基因及细菌16S rRNA，从而实现一胞共检，同时测宿主和胞内菌信息。

图6：SeekOne® DD单细胞转录组+HS-16S技术原理

  综上，高通量单细胞转录组技术的拓展，实现一次对上万个细胞转录组特征和胞内细菌的鉴定。不仅可以鉴定胞内细菌多样性组成，还可以联合宿主细胞转录组信息，分析胞内菌的细胞分布特征，解析有无胞内菌感染的肿瘤细胞或免疫细胞中的差异基因和信号通路改变，阐明胞内细菌对宿主细胞的作用。但是目前单细胞胞内菌的研究很少，相应的生物信息分析方法需要进一步完善。且随着技术不断突破，今后有希望实现宿主细胞基因表达和胞内细菌基因信息和功能注释共同检测。

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  2、Chattopadhyay AN, Jiang M, Makabenta JMV, Park J, Geng Y, Rotello V. Nanosensor-Enabled Detection and Identification of Intracellular Bacterial Infections in Macrophages. Biosensors (Basel). 2024 Jul 25;14(8):360. doi: 10.3390/bios14080360.

  3、Hamza T, Li B. Differential responses of osteoblasts and macrophages upon Staphylococcus aureus infection. BMC Microbiol. 2014 Jul 25;14:207. doi: 10.1186/s12866-014-0207-5.

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  6、Robinson W, Stone JK, Schischlik F, et al. Identification of intracellular bacteria from multiple single-cell RNA-seq platforms using CSI-Microbes. Sci Adv. 2024;10(27):eadj7402. doi:10.1126/sciadv.adj7402

  7、Galeano Niño JL, Wu H, LaCourse KD, et al. INVADEseq to identify cell-adherent or invasive bacteria and the associated host transcriptome at single-cell-level resolution. Nat Protoc. 2023;18(11):3355-3389. doi:10.1038/s41596-023-00888-7