靶点结合（Target Engagement）是贯穿药物研发全流程的核心验证指标，其通过精准量化药物-靶点相互作用特性，显著提升研发成功率并降低风险。本文系统梳理了靶点结合检测技术选择框架，为临床前研究提供关键决策支持，助力实现理性、高效的药物开发。由于文章篇幅较长，为了避免阅读疲劳，将分多期发表。

 早期药物研发中的靶标结合（Target Engagement）（一）

早期药物研发中的靶标结合（Target Engagement）（二）：热分析技术

  生物传感器是由生物感应元件组成的装置，能够检测化学物质或其他生物分子的存在。该技术广泛应用于医学诊断、化学检测以及药物研发领域，用于识别和表征靶标结合作用。生物传感器使用的术语与其他方法有所不同：固定化的蛋白质通常被称为"配体"，而小分子配体则被称为"分析物"。

  由于生物传感器与其分析物之间的相互作用可被实时检测，因此可用于测定结合动力学参数kon（结合速率常数）和koff（解离速率常数）。此外，生物传感器通常仅需低浓度的蛋白质和分析物，且大多数情况下无需标记，省去了荧光标记、放射性标记或化学标记的步骤。

  大多数生物传感器需要将靶蛋白固定在载体表面。常用的固定方法是在金表面上使用羧甲基葡聚糖基质（图12a），通过葡聚糖表面的游离羧基与蛋白质残基结合来实现固定。当然，还有许多其他表面材料可供选择，且新的蛋白质固定方法也在持续开发中。

Figure 12. a) A CM dextran matrix on a gold surface can be used to capture proteins for biosensing applications. b) Biosensors use microfluidic systems to flow the analyte over the immobilized protein surface. c) A typical response readout from a biosensor, the response increases as the analyte is flowed over the surface until a maximum is reached. When buffer is added to wash away the analyte, the response decreases as the compounds dissociate.

  生物传感器通常依赖于微流控系统。首先将蛋白质从溶液中固定在表面上，然后洗去未结合的过量蛋白质。进行测量时，使分析物流经含有蛋白质的表面（图12b），实验结束时用缓冲液洗去分析物。这一过程可重复进行，使用不同浓度的分析物或不同种类的分析物。在某些情况下，可通过切割去除蛋白质来回收表面。

  在药物发现中最普遍使用的生物传感器是SPR，但也应用了许多不同的传感技术。一般来说，生物传感器响应的变化是由生物层折射率的变化引起的。折射率的差异与质量变化有关，在这种情况下，即分析物与表面结合的蛋白质相互作用时。生物传感器的读数通常相似，随着配体结合，传感器的响应增加至最大值，随后随着分析物从表面被洗去而降低（图12c）。响应随时间变化的曲线形状可以提供关于结合机制的信息，例如是否是质量传输受限或分析物是否不可逆地结合到表面。

  生物传感器需要将蛋白质固定在表面上，因此建立新的检测方法可能非常耗时。固定化还可能导致蛋白质结合特性的改变。由于微流控系统的存在，也可能出现与质量传输限制相关的假象。

  除了这里介绍的技术外，还开发了其他生物传感器。这些包括马赫-曾德尔干涉仪（MZI）、杨氏干涉仪（YI）、双偏振干涉仪（DPI）、表面声波（SAWs）、落射荧光（EPF）和石英晶体微天平（QCM）。然而，迄今为止，这些技术在观察蛋白质-配体相互作用以用于药物发现方面的应用非常有限，因此不再进一步讨论。同样，共振镜（RM）生物传感器于1993年首次商业化，但目前已基本停用。二次谐波（SHG）生物传感器也是如此，它于2016年作为Biodesy Delta系统商业化。共振波导光栅（RWG）生物传感器的使用远不如其他技术普遍，但它们已被开发用于监测蛋白质-分析物相互作用以进行化合物筛选。背向散射干涉仪（BSI）于2007年首次开发用于监测蛋白质与分析物之间的相互作用，尽管它具有不需要固定化蛋白质的优点，但仪器尚未商业化，因此在药物发现领域的应用有限。

  3.1 表面等离子体共振（SPR）技术

  SPR是监测蛋白质-配体相互作用及测定动力学参数最常用的生物传感技术。其工作原理为：在全反射条件下，入射光通过棱镜照射至传感器芯片表面（通常为金膜）后反射至检测器。当入射光达到特定共振角时，金膜中的电子通过吸收光子能量被激发，产生表面等离子体激元。这一现象导致共振角处反射光强度因能量吸收而显著衰减（图13a）。生物层折射率的变化会改变共振角位置，而折射率差异直接反映表面结合物质的质量变化。

Figure 13. a) Setup of an SPR experiment. Monochromatic light passes through a prism onto a gold surface and is reflected off the surface into a detector. At the resonant angle there is a reduction in intensity of reflected light. The resonant angle is sensitive to refractive index changes, which is influenced by protein–analyte interactions on the gold surface. b) SPR with intact cells can be used to detect interactions with surface bound proteins and their analytes.

  SPR技术已广泛应用于化合物筛选与验证，其高灵敏度特性使其能够有效支持基于片段的药物发现（FBDD）。此外，该技术还可用于分析PROTACs（蛋白降解靶向嵌合体）三元复合物的形成动力学。在检测模式方面，SPR既可通过固定小分子来研究其与表面结合蛋白的相互作用，也可直接检测固定化细胞与分析物的结合（图13b）。虽然目前细胞检测技术主要应用于医学诊断领域，但该方法为膜结合蛋白分析物的评估提供了潜在的有力工具。

  3.2 光栅耦合干涉测量技术（GCI）

    GCI是另一种监测生物层折射率变化的光学生物传感器。在该技术中，激光通过光栅耦合进入波导，随后光线穿过带有生物层表面的波导并产生相位偏移。参考光束随后也被耦合进入波导，从而产生干涉效应。组合光波通过第三个光栅从波导中解耦，最终在检测器上测量干涉图样（图14）。与仅监测局部区域的SPR技术不同，GCI对整个表面进行采样，因此具有更高的检测灵敏度（97）。

    Crieoptix（现为Malvern）的科学家开发了"递增时长重复分析物脉冲（waveRAPID）"技术，显著提高了GCI动力学实验的通量。该创新方案通过增加注射次数（而非制备不同浓度的样品）来实现分析物浓度的梯度变化（98）。

Figure 14. Setup of a GCI experiment. A grating couples a laser beam through a waveguide. The biolayer on the waveguide causes a variable phase shift due to changes in refractive index. A reference beam is added which interferes with the sample beam and the output is coupled out of the waveguide with another grating, giving a time-resolved phase shift.

  与SPR类似，GCI技术同样适用于化合物库筛选、活性分子验证以及片段化合物筛选（98）。然而，该技术目前尚未在基于细胞的应用中得到实际验证。

  3.3 生物层干涉技术（BLI）

  BLI是另一种无标记光学生物传感器。与其他传感器的关键区别在于，BLI不使用微流控系统，其生物传感器表面位于光纤探针的末端，可浸入各种分析物溶液中。BLI的工作原理是将白光照射到光纤探针末端，该末端由光学层和含有固定化蛋白质的生物层组成（图15）。光线被反射，如果分析物结合，反射光束的波长将发生变化。由于不使用微流控系统，BLI可应用于复杂或粘稠的溶液（如植物和微生物提取物），并且对DMSO等有机溶剂的耐受性优于SPR。BLI适用于中等规模化合物库的筛选，以及分析PROTACs中三元复合物的形成。

Figure 15. Setup of a BLI experiment. Light is passed through an optical fiber containing an optical layer and biolayer at the tip. The wavelength of the reflected beam is influenced by the thickness of the biolayer. The tip is dipped into various solutions of analyte.

  3.4 电控纳米杠杆技术（SwitchSense）

  SwitchSense技术于2013年首次开发，用于测定蛋白质的形状和大小。在该技术中，双链DNA被固定于金芯片表面，通过施加交变电势使其与表面产生吸引和排斥作用（图16）。其中一条DNA链标记有荧光基团，当靠近金表面时会发生荧光淬灭，因此荧光检测器可实时确定DNA链的取向。在药物-靶标结合应用中，互补链上连接有靶标蛋白，可与配体相互作用。配体结合可通过DNA链摆动动力学的变化被检测到。

Figure 16. Theory of a SwitchSense experiment. An alternating electric potential attracts and repels ds-DNA to a gold surface, switching on and off fluorescence. One strand of the ds-DNA contains the switchable fluorophore, whereas the other can be tethered to a protein of interest. Binding of a ligand to this protein can be detected as changes in the switching dynamics of the DNA.

  3.5 磁力光谱技术（MFS）

  生命科学工具公司Depixus开发的MAGNA One仪器能够利用MFS技术分析蛋白质-配体和蛋白质-蛋白质相互作用（图17）。其工作原理是通过监测磁性微珠在施加磁力时的垂直高度变化来实现的，该微珠通过DNA链固定在表面上。蛋白质和配体通过互补DNA序列标签分别连接在DNA链的远端位置。当施加较弱的磁力时，蛋白质和配体会保持结合状态，微珠维持在较低位置；而当施加较强的磁力时，蛋白质和配体会分离，微珠将垂直向磁体方向移动。微珠达到最大高度所需的时间可以反映蛋白质与配体之间的结合强度。

Figure 17. Magnetic force spectroscopy to analyze protein–ligand interactions. The protein and ligand are bound to a tethered DNA strand with a magnetic microbead. As a magnetic force is applied the bead will be attracted to the magnet, causing the protein and ligand to separate. Delays in the time for the bead to reach the full hight upon applying this increased force is related to the strength of the protein–ligand interaction.

  当两个蛋白质同时结合于DNA链时，该技术可用于监测蛋白质-蛋白质相互作用，并指导分子胶和PPI抑制剂的开发。

  3.6 全内反射荧光显微镜技术（TIRF）

  全内反射现象发生在光线以超过临界角的角度从界面反射进入较低折射率介质时。这会产生在表面短距离内衰减的电磁倏逝场。该电磁场可用于激发附近的荧光团，并通过显微镜进行观察。TIRF显微镜已通过一种称为"溶液中动态抑制分析（dISA）"的技术，用于监测膜结合蛋白与配体的相互作用。其实现方式是将目标蛋白和荧光团共同包埋于囊泡中。当蛋白与生物传感器表面的工具化合物结合时，荧光团会被倏逝波激发（图18）。竞争性结合配体的存在会减少蛋白与表面的相互作用，从而降低荧光信号。实验通过监测有无配体存在时结合事件数量随时间的变化进行分析。

Figure 18. Dynamic Inhibition-in-Solution Assay (dISA) using TIRF Microscopy. A vesicle containing the membrane protein of interest and a fluorescent dye interacts with a tool compound on the surface of a TIRF biosensor. This brings the dye in proximity to the surface where it is excited by the effervescent wave and fluoresces. Addition of a competitive ligand reduces the interactions with the protein and tool compound and so fluorescence viewed in the microscope is reduced.

  早期药物研发中的靶标结合（Target Engagement）（一）

  早期药物研发中的靶标结合（Target Engagement）（二）：热分析技术

  本文主要内容来源于JMC文章，由于篇幅比较长，将分成多个部分（其中本部分为第二部分），每个部分聚焦一类技术，希望为药物研发科学家提供一个全面的工具集合，在项目研发中选择使用。  

Refenrence：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.4c03115