靶点结合（Target Engagement）是贯穿药物研发全流程的核心验证指标，其通过精准量化药物-靶点相互作用特性，显著提升研发成功率并降低风险。本文系统梳理了靶点结合检测技术选择框架，为临床前研究提供关键决策支持，助力实现理性、高效的药物开发。由于文章篇幅较长，为了避免阅读疲劳，将分多期发表。

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   早期药物研发中的靶标结合(Target Engagement)(一)

   早期药物研发中的靶标结合(Target Engagement)(二): 热分析技术

   早期药物研发中的靶标结合(Target Engagement)(三): 生物传感技术

  质谱技术是研究药物-靶标相互作用的重要工具。质谱仪由电离源、质量分析器和检测器组成。电离源将分子电离并转移至气相，离子随后按质荷比（m/z）分离后被检测，最终形成m/z与离子丰度或强度的质谱图。多种电离技术和质量分析器的组合可提供不同灵敏度和通量的质谱数据。该技术无需标记，因此较少受其他检测方法中潜在干扰的影响。

  完整蛋白质的质量可通过天然质谱（Native MS）观测。基于亲和力的质谱（AS-MS）则通过分析配体与靶蛋白结合后的质谱变化进行筛选，包含多种技术手段，广泛应用于化合物和片段筛选。氢氘交换质谱（HDX-MS）虽然通量较低，但可用于深入研究蛋白质-配体复合物的结合位点信息。

  4.1 天然质谱（Native MS）

  天然质谱用于研究完整折叠的蛋白质及其与小分子配体形成的非共价复合物。该技术通常采用电喷雾电离（ESI）方法，能够确定结合是否存在、结合化学计量比、解离常数（KD）并估算结合焓变。天然质谱的优势在于无需标记或交联，且仅需皮摩尔级的样品量。然而，ESI能否将复合物的溶液结构完整保留到气相中仍存在疑问，因为蛋白质可能会快速解折叠。

  在天然质谱分析中，首先通过凝胶过滤、尺寸排阻色谱（SEC）或透析制备蛋白质的挥发性溶液。随后加入配体，再通过ESI-MS分析样品（图19a）。这将得到一个包含蛋白质和蛋白质-配体复合物所有不同电荷状态的质谱图（图19b），通过去卷积处理可以得到游离蛋白质与蛋白质-配体复合物的比例（图19c）。

Figure 19. Workflow and results of a Native MS experiment. a) Volatile protein–ligand solutions are prepared and analyzed by ESI-MS. b) A mass spectrum of all the possible charges is generated which c) is deconvoluted to give the ratio of protein:protein–ligand complex.

  天然质谱（Native MS）具有单孔可筛选多种化合物的优势，已成功应用于化合物库筛选，包括片段化合物的筛选，这得益于自动化技术的改进。该技术还应用于共价药物发现，用于鉴定共价片段和类药分子。

  2017年，研究人员成功实现了大肠杆菌裂解液中蛋白质-配体复合物的分析。近期更在人类红细胞中成功进行了天然质谱实验，这表明未来可能实现直接在细胞内观察蛋白质-配体相互作用的细胞天然质谱实验。

  4.2 基于亲和力的选择质谱（AS-MS）

  AS-MS是初级筛选中最常用的生物物理技术。该技术通过分析小分子配体与目标蛋白基于亲和力分离后的质谱来进行检测。根据亲和力差异分离配体的方法有多种（图20）。在AS-MS中，最广泛应用的是SEC、PUF和MagMAS，不过FAC、ED和SAMDI也被用于基于配体与目标蛋白亲和力的分离。AS-MS的优势在于可以同时检测多个化合物，且不需要放射性同位素或生色团标记，也不受荧光干扰。自1997年首次开发以来，AS-MS已被用于自动化筛选流程，这得益于更灵敏的声雾化质谱技术的应用（118）。

Figure 20. Separation techniques to discriminate ligands by binding affinity in AS-MS, strongly binding ligands are shown in orange and weak binders in purple. a) SEC: free nonbinding ligands and protein–ligand complexes are separated by size. b) PUF: unbound ligands are separated from complexes by pulsed filtration through a membrane. c) Mag-MS: The protein is bound to magnetic beads which enables washing away of unbound ligands following application of a magnet. d) FAC: ligands are passed through a column of immobilized protein; a void marker (shown in black) followed by weakest binders will elute first. e) ACE: free protein, protein–ligand complexes and free ligands move across an electrophoresis capillary at different velocities dependent on their size and charge. f) SAMDI: protein–ligand complexes are immobilized on a gold surface and analyzed by MALDI. g) CIAS: separation of bound and unbound ligands is achieved in a quadrupole after ionization by ESI. The protein and ligands are dissociated in a collision cell and then the masses of the small molecule ligands are detected.

  4.2.1 尺寸排阻色谱-质谱联用技术（SEC-MS）

  SEC色谱柱包含球形填料颗粒，这些颗粒不吸附化合物，但能根据分子尺寸差异实现分离（图20a）。大分子如蛋白质及其复合物无法进入填料孔隙，因此会先被洗脱出来。SEC色谱柱的微型化使其能够与质谱联用，用于针对生物靶标的化合物筛选。蛋白质-配体复合物通过SEC柱后，需使用液相色谱（LC）进行变性处理以释放结合配体，再进行质谱分析。该技术最初由NeoGenesis公司于2004年开发，命名为自动化配体识别系统（ALIS）。与此同时，诺华公司开发了SpeedScreen平台，采用微孔板SEC替代连续流动模式。

  4.2.2 脉冲超滤-质谱联用技术（PUF-MS）

  在PUF-MS中，超滤膜允许未结合配体通过，而将与靶蛋白结合的配体截留（图20b）。随后通过有机溶剂或pH变化使复合物变性，释放结合配体，再进行MS或LCMS分析。

  4.2.3 磁性微珠亲和筛选-质谱联用技术（MagMAS-MS）

  通过将蛋白质固定在磁性微珠上，施加磁场并洗涤可分离蛋白-配体复合物与未结合配体（图20c）。与其他方法类似，结合配体需通过蛋白变性释放，再进行LCMS分析。该技术已证实适用于GPCR靶点的基于片段的药物发现（FBDD）。

  4.2.4 前沿亲和色谱-质谱联用技术（FAC-MS）

  与"捕获-释放"方法不同，FAC通过分析物分子通过固定化蛋白亲和柱的延迟时间来评估结合强度（图20d）。SARomics和RG Discovery公司开发了基于FAC-MS的片段筛选平台——弱亲和色谱（WAC）。该技术近期已实现微型化，并应用于膜蛋白的片段筛选。

  4.2.5 亲和毛细管电泳-质谱联用技术（ACE-MS）

  ACE-MS于1996年首次用于组合库筛选。其原理是基于电泳迁移率的变化——分子在毛细管电泳中的移动速度取决于其电荷和尺寸，游离配体与其复合物存在差异（图20e）。与FAC-MAS类似，配体通过电泳毛细管的延迟时间可反映结合强度，弱结合配体洗脱更快。

  4.2.6 自组装单层解吸电离技术（SAMDI）

  SAMDI结合了金表面的自组装单层与MALDI-MS技术。虽然主要用于酶活性检测，但2017年首次用于非共价配体分析。该方法中，化合物与生物素化蛋白孵育形成复合物后，加入链霉亲和素包被的SAMDI板捕获蛋白（图20f）。洗涤去除未结合化合物后，通过小分子MALDI检测结合配体的质量。

  4.2.7 碰撞诱导亲和选择质谱（CIAS-MS）

  CIAS-MS由Liu和Quinn于2022年首次报道。与其他需要在质谱前分离结合/未结合配体的AS-MS技术不同，CIAS-MS可在质谱仪内完成结合配体的区分与分析。在CIAS-MS中，蛋白-配体混合溶液经ESI源电离后进入四极杆，四极杆捕获复合物并排除未结合小分子。蛋白-配体复合物经碰撞诱导解离后，分析小分子配体的质量（图20g）。值得注意的是，CIAS-MS可用于分析复杂混合物（如植物提取物）中配体的相互作用。

  4.3 氢氘交换质谱（HDX-MS）

  在HDX-MS中，通过分析蛋白质表面可接触和可交换的质子与氘代缓冲液发生交换的程度来获取信息。这可以提供结合位点的相关信息，因为参与配体结合的氨基酸残基上的氢氘交换量会与蛋白质表面其他区域不同。HDX-MS特别适用于为难以结晶的蛋白质提供结构信息。HDX-MS有三种可能的工作流程：自下而上（bottom-up）、自上而下（top-down）或中向下（middle-down）。所有方法都涉及将蛋白质在D2O缓冲液中孵育，导致表面不稳定的NH、OH和SH基团发生氢氘交换，然后通过降低pH值来淬灭反应。

    最常用的技术是自下而上HDX-MS，其中在氢氘交换后，蛋白质被变性，用蛋白酶切割成较小的肽段，然后通过LCMS分析所得的肽段片段（图21a）。这些谱图与在非氘代缓冲液中进行的实验进行比较，以确定每个肽段片段的氘代百分比（图21b）。每个片段在有配体和无配体存在时的氘代百分比可以帮助确定蛋白质上可能的结合位点（图21c）。最佳的酶消化会产生重叠的残基（通常为5-30个氨基酸长），这使得能够确定哪些肽段（而不仅仅是哪些片段）已被氘代。值得注意的是，在LC柱上可能会发生交换位点的重新质子化，称为反向交换（back-exchange）。这就是为什么尽管肽段片段的分离效果较差，但通常只使用少于15分钟的短LC方法。

Figure 21. Bottom-up HDX-MS. a) Surface exchangeable protons are exposed to a deuterated buffer leading to exchange before the reaction is quenched and the protein digested into peptide fragments. b) The fragments are analyzed by LCMS and compared to their non deuterated counterparts to determine the percentage deuteration. c) Comparison of the deuteration of the peptide fragments of free protein with ligand bound protein can provide information about the binding site.

  最近，氢氘交换质谱（HDX-MS）与亚零温超高效液相色谱（UPLC）联用技术的结合提高了检测通量，并实现了在大肠杆菌裂解液中的分析。近期还有研究报道了在活大肠杆菌细胞中应用HDX-MS技术检测BtuB蛋白的体内结构，这为未来开发研究活细胞内蛋白质-配体相互作用的方法提供了概念验证。

  较少使用的HDX-MS形式包括自上而下和自中而下两种方法。自上而下HDX-MS与天然质谱类似，都是通过电喷雾电离质谱（ESI-MS）分析完整蛋白质，用于观察蛋白质的整体变化。自中而下HDX-MS则是自下而上和自上而下方法的混合体，使用酶消化蛋白质，但产生较长的肽段片段，然后通过ESI进行分析。

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   早期药物研发中的靶标结合(Target Engagement)(二): 热分析技术

   早期药物研发中的靶标结合(Target Engagement)(三): 生物传感技术

  本文主要内容来源于JMC文章，由于篇幅比较长，将分成多个部分（其中本部分为第二部分），每个部分聚焦一类技术，希望为药物研发科学家提供一个全面的工具集合，在项目研发中选择使用。

Refenrence：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.4c03115