靶点结合（Target Engagement）是贯穿药物研发全流程的核心验证指标，其通过精准量化药物-靶点相互作用特性，显著提升研发成功率并降低风险。本文系统梳理了靶点结合检测技术选择框架，为临床前研究提供关键决策支持，助力实现理性、高效的药物开发。由于文章篇幅较长，为了避免阅读疲劳，将分多期发表。

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 早期药物研发中的靶标结合(Target Engagement)(一)

 早期药物研发中的靶标结合(Target Engagement)(二): 热分析技术

 早期药物研发中的靶标结合(Target Engagement)(三): 生物传感技术

 早期药物研发中的靶标结合(Target Engagement)(四): 质谱技术

  有两种核磁共振（NMR）波谱技术可用于观察药物-靶标相互作用。在配体观测NMR（LO-NMR）中，观察配体在蛋白质存在下的积分值和弛豫率等NMR参数。蛋白质观测NMR（PO-NMR）则检测蛋白质自身的NMR谱图，通常使用同位素标记来简化谱图。这两种方法都需要相对大量的高纯度、稳定性好的蛋白质，不过随着电子设备的改进、更高磁场强度和低温探头的应用，过去10年NMR的灵敏度提高了10倍以上，减少了所需样品量和采集时间。NMR检测非常适合片段筛选，因为它可以在高浓度配体下工作，这对于检测弱抑制剂是必需的。使用基于NMR的检测方法可以帮助确认分光光度法检测的结果，特别是在紫外-可见吸收谱重叠可能使分析复杂化的情况下。

  5.1 配体观测NMR（LO-NMR）

  在LO-NMR中，分析小分子的¹H或¹⁹F NMR谱图在目标蛋白质存在下的变化。在这一类别中，已经开发了几种方法，观察配体与蛋白质结合时各种NMR参数的变化。这些方法大致分为基于弛豫的方法和基于核欧沃豪斯效应（NOE）的方法。通过使用配体混合物可以提高LO-NMR实验的通量。由于LO-NMR可以容易地检测到弱结合配体，因此它非常适合基于片段的药物发现（FBDD）。LO-NMR已被用于筛选针对挑战性靶点如蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的化合物。使用LO-NMR实验的一个局限是难以识别强结合配体，以及需要高度可溶的化合物，不过可以通过使用竞争实验来解决这个问题。需要高浓度配体也可能导致化合物聚集，在解释结果时应考虑这一点，特别是对于灵敏度较低的基于NOE的方法。

  5.1.1 基于弛豫的方法

  与蛋白质结合会影响配体的横向弛豫速率（R2）。利用结合和未结合配体之间横向弛豫速率差异的LO-NMR实验可以轻松设置，以定性确定是否发生结合。由于质子普遍存在于有机化合物中且对NMR分析具有高灵敏度，1H NMR波谱最常被使用。一般来说，虽然使用各种脉冲序列并测量各种参数，但蛋白质的加入会导致配体信号强度降低（图22）。如果随后加入竞争分子，随着配体从蛋白质上被置换出来，信号会增加。

Figure 22. 1H NMR spectra during LO-NMR spectroscopy using transverse relaxation-based methods. a) 1H NMR spectra of free ligand. b) When combined with protein, the signals for the ligand protons are reduced if binding occurs.

  配体信号的线宽与横向弛豫速率（R2）成正比。通过使用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脉冲程序，可以将线宽变化转化为峰高的变化（因此更容易观察）。对于使用该脉冲程序获取的谱图，NMR信号的强度（峰高）与配体的横向弛豫速率（R2）以及脉冲程序中的延迟时间设置成正比。当延迟时间较长时，具有快速弛豫速率的分子（如与蛋白质相互作用的配体）的NMR信号可能会完全消失，从而提供靶标结合的证据。

  最近，已开发出使用横向弛豫速率（R2）作为可测量参数的定量LO-NMR方法。该方法特别适用于解离常数（KD）在10μM至1mM范围内的基于片段的药物发现（FBDD）。

  5.1.2 基于梯度谱的水-配体观测技术（WaterLOGSY）

  WaterLOGSY技术基于质子磁化从激发态水分子向配体的转移机制，具体通过以下两种途径实现：
    （A）直接转移（产生正NOE效应）
    （B）通过蛋白质表面质子的初始转移（产生负NOE效应）（图23）。结合态与游离态配体在转移行为上的差异源于分子在溶液中的翻滚速率不同：游离分子翻滚速率快，而结合分子翻滚速率慢。

Figure 23. a) In a WaterLOGSY experiment, water molecules are selectively excited. NOE can occur A) directly from excited water molecules to a ligand or B) via transfer to protons at a protein surface. b) A 1D 1H NMR spectrum of a mixture of ligands is compared to the WaterLOGSY NMR spectra c) ligands that bind will have a negative NOE.

  WaterLOGSY技术已被报道可用于测定化合物和片段的KD值。溶剂可及性、配体结合及配体取向核磁共振图谱（SALMON）是一种改进的水LOGSY实验，可进一步阐明配体的结合模式。

  5.1.3 饱和转移差示核磁共振（STD-NMR）

  STD-NMR波谱技术基于从蛋白质到结合配体的饱和转移。这一过程通过高斯软脉冲选择性饱和整个蛋白质的共振信号来实现（图24）。当配体与蛋白质结合时，饱和将通过1H-1H交叉弛豫转移至配体。值得注意的是，只有直接参与结合的质子1H NMR信号才会获得高度饱和，因此该技术可以提供分子中参与关键结合相互作用的部位信息。

Figure 24. STD NMR spectrum shows the changes in intensities for ligand protons between the free ligand and after the protein has been saturated by Gaussian soft pulses. The largest signals show the protons most involved in protein–ligand binding.

  5.1.4 基于配体间NOE的药效团定位技术（INPHARMA）

  INPHARMA技术基于NOE效应，但与观察水-蛋白质（water-LOGSY）或蛋白质-配体（STD）间NOE不同，它研究的是两个配体之间的NOE效应。在INPHARMA实验中，记录两个配体在蛋白质存在下的NOESY谱图。如果它们结合在相同位点，只要配体交换速率足够快，就能观察到结合质子的NOE信号，该信号源自磁化从一个配体转移到蛋白质，再从蛋白质转移到第二个配体的过程。

  5.1.5 靶标固定化NMR筛选（TINS）

  TINS是唯一使用固定化蛋白质的LO-NMR方法。这意味着配体可以被洗脱，蛋白质可以重复用于后续实验，从而减少蛋白质消耗（139,150）。TINS技术已实现2000个化合物的筛选而不会降低表面活性，非常适合基于片段的药物发现（FBDD）。

  5.1.6 蛋白质侧链自旋标记互作化合物鉴定技术（SLAPSTIC）

  SLAPSTIC于2002年首次开发，旨在提高LO-NMR的灵敏度并减少蛋白质消耗。该方法使用有机氮氧自由基作为自旋标记，通过顺磁弛豫增强效应降低邻近配体的信号强度。然而，该方法依赖于对蛋白质或配体上特定残基的选择性标记。

  5.1.7 氟化学位移各向异性交换技术（FAXS）

  氟核具有快速弛豫特性，可提高NMR检测灵敏度。氟信号对环境变化高度敏感，且生物分子中通常不含氟，因此19F NMR在蛋白质-配体结合研究中具有独特优势。在LO-NMR中，可采用氟化学位移各向异性交换筛选（FAXS）技术。与1H NMR实验类似，FAXS观察配体结合蛋白质时的信号减弱（图25a），或在竞争实验中观察被置换报告分子信号的增强（图25b）。近期发展的化学位移各向异性亲和力排序（CSAR）技术，无需滴定或同位素标记即可通过弛豫数据直接评估氟化配体的结合亲和力。

Figure 25. 19F NMR spectra for FAXS NMR spectroscopy. a) Intensity of the signal for fluorinated ligands will be reduced on addition of protein. b) Competitive FAXS: addition of a ligand can displace a fluorinated reporter molecule

  由于生物分子中天然缺乏19F，19F NMR实验特别适用于细胞内检测。最近，通过置换细胞内与靶蛋白结合的氟化报告分子，成功测定了活细胞中多种Hsp90α配体的KD值（155）。

  5.1.8 光化学诱导动态核极化技术（Photo-CIDNP）

  超极化技术可提高LO-NMR检测小分子与生物靶标相互作用的灵敏度，从而降低样品浓度需求。在Photo-CIDNP中，蛋白质-配体混合物在光敏剂存在下进行辐照，在光敏剂与配体之间形成自由基对。通过这种自由基对机制，蛋白质结合配体的极化被淬灭，因此该方法可用于定量结合。然而，并非所有配体都能通过该技术实现超极化，估计仅有25-30%的生物活性分子适用，不过目前正在开发适用的片段库。此外，也可通过研究可极化工具化合物的置换来筛选更多样化的化合物库。

  5.2 蛋白质观测NMR（PO-NMR）

  PO-NMR可用于研究蛋白质动态特性、测定配体亲和力并提供结合位点信息。由于蛋白质分子量大，其NMR谱图复杂。因此，许多PO-NMR技术使用同位素标记的蛋白质，不过其制备成本仍然较高。与LO方法相比，PO-NMR的数据解析通常更耗时，但除了结合确认外，还能提供蛋白质结构信息。

  5.2.1 ¹H-¹⁵N NMR异核单量子相干谱（¹H-¹⁵N HSQC）

  最常用的PO-NMR实验是使用¹⁵N标记残基的二维¹H-¹⁵N NMR异核单量子相干谱（HSQC）。基于¹⁵N标记蛋白质的化学位移扰动（CSP）是NMR测定KD值的金标准。该方法追踪配体加入后蛋白质化学位移的变化（图26）。如果标记位点已知且蛋白质结构已解析，CSP实验可确定结合位点位置，因为位移最大的峰最可能对应蛋白质的结合区域。

Figure 26. Most PO-NMR experiments are based on 2D 1H–15N NMR HSQC using proteins with 15N labeled amino acid residues. Analysis of changes in chemical shift with and without ligands can be used to identify binding affinities and locate the binding site. The signals for the residues involved in ligand binding will be shifted the most.

  PO-NMR技术以往主要局限于40 kDa以下的蛋白质研究，但通过对特定氨基酸类型的选择性标记，现已突破这一限制。方法学改进也提高了PO-NMR在筛选小分子和片段化合物方面的通量。

  波段选择性优化翻转角短时异核多量子相干谱（SOFAST-HMQC）是一种脉冲序列，于2005年首次开发，用于缩短1H-15N NMR相关谱的采集时间。该技术显著提高了PO-NMR实验的通量，目前已广泛应用于化合物筛选。

  横向弛豫优化谱（TROSY）于1997年首次开发，该脉冲程序通过抵消偶极耦合与化学位移各向异性（CSA）间的相互作用，能够在1H-15N NMR谱中获取更尖锐的蛋白质信号峰，特别适用于大分子量蛋白质（>30 kDa）研究。甲基-TROSY技术也得到发展，该技术利用蛋白质上甲基的13C标记。

  5.2.2. 1D1H-Aliph NMR Spectroscopy

  最简单的PO-NMR方法可能是观察蛋白质在配体存在和不存在时1H NMR谱图中脂肪族区域（0.7 ppm以下）的信号变化（图27）。该区域包含蛋白质上靠近芳香族侧链的甲基信号。通过该区域的化学位移扰动（CSP）观察，可以估算滴定配体的解离常数。但使用此方法的前提是该区域信号必须在配体结合时发生显著变化，因此仅适用于特定情况。

Figure 27. In 1D 1H NMR Spectroscopy of a protein, changes in chemical shift in the simpler low aliphatic region can be used to provide information about ligand binding.

  5.2.3 细胞PO-NMR检测

  尽管信噪比仍是一个重大挑战，但过去20年的创新表明，标准的PO-NMR技术（如1H-15N HSQC）可在活细胞环境中应用。虽然该领域仍在发展中，但一项初步研究已证明，可以在细胞内针对人碳酸酐酶（CA2）获得已知抑制剂的配体结合曲线。

  结构相互作用细胞内NMR（STINT-NMR）是一种1H-15N HSQC方法，于2006年首次开发用于蛋白质-蛋白质相互作用的细胞内分析（165）。此后，该方法已被多个研究小组应用于筛选介导蛋白质-蛋白质相互作用的小分子（166,167）。

  5.2.4 19F氟蛋白观测NMR（PrOF）

  蛋白质可以用19F原子标记，这种方法特别有用，因为氟可以作为氢原子的等排替代。在PrOF中，标记蛋白质上19F信号的化学位移扰动可以确定配体结合的程度（图28）。这些实验还能观察到非特异性效应，如蛋白质聚集或变性，从而排除假阳性结果。

Figure 28. PrOF, binding of ligands causes changes in the chemical shift of 19F enriched proteins.

  2023年，Banci、Luchinat及其研究团队证实，19F标记的蛋白质可在人类细胞中表达。当加入已知配体时，可检测到人类细胞或裂解液中氟化碳酸酐酶（CA2）19F NMR信号的位移或消失现象。

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 早期药物研发中的靶标结合(Target Engagement)(四): 质谱技术

  本文主要内容来源于JMC文章，由于篇幅比较长，将分成多个部分（其中本部分为第二部分），每个部分聚焦一类技术，希望为药物研发科学家提供一个全面的工具集合，在项目研发中选择使用。 

Refenrence：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.4c03115